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1、MTT实验标准操作流程1. 原理活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（即OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。2. 试剂及耗材CO2细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜 、低速离心机、酶标仪、8道排枪、培养基 胎牛血清 、MTT、 DMSO、96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板3. 注意事项MTT
2、溶液的配制，通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。MTT一般最好现用现配，0.22m过滤后4避光保存两周内，或配制成5mg/ml保存在-20长期保存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解，当MTT变为灰绿色时不能再用。DMSO可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。4. 实验步骤：4.1 细胞标准曲线制作4.1.1 0.5%的胰酶消化对数期细胞，待细胞即将脱离皿底时，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养
3、基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10104/ml。4.1.2 取4块96孔板，分别标记为0h、24h、48h、72h，每组设置3个复孔，每孔加入100 L细胞悬液，每板分别铺8组细胞，分别为3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应。4.1.3 5%CO2，37培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测： a) 每孔加入10 L MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h； b) 小心吸去孔内培养液； c) 每孔加入150L DMSO，使结晶物充分溶解； d) 加DMSO后10
4、min内，用酶标仪检测各孔波长l570nm的吸光值；4.1.4 标准曲线制作以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。选择合适的细胞浓度进行实验。4.2 MTT药物毒性实验步骤4.2.1 0.5%的胰酶消化对数期细胞，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10104/ml，药物毒性实验一般每孔细胞数量500010000个（具体数目根据预实验判断）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。4.2.2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入90l细
5、胞悬液, 这样待测细胞的密度为500010000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加5个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。4.2.3 5%CO2，37培养箱继续培养，待细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物。（原则上，细胞贴壁后即可加药，或两h，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。加药时按照所需的浓度在EP管中先稀释好，每孔加入10l已经稀释好药物，使每孔最终体积为100l，为了避免产生误差，稀释好的药物体积应略大于所需药物的体积。需要注意的是，以DM
6、SO作为溶剂溶解的药物至少需要进行100倍以上稀释才能使用，因为作用于细胞DMSO的含量高于1%时，DMSO会杀死细胞从而影响判断。）4.2.4 按照药物作用时间点，每24 h取出一块96孔板检测：a) 每孔加入10 L MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h； b) 小心吸去孔内培养液； c) 每孔加入150L DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解； d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长570nm的吸光值；4.2.5同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。4.2.6 M
7、TT结果分析IC50值可以通过Graphpad prism5进行计算4.3 MTT增殖实验4.3.1 分别收集各组对数期的细胞，调整细胞悬液浓度； 4.3.2 取4块96孔板，每孔加入100 L细胞悬液，铺板使待测细胞为5103 cell/孔（边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应），每组设置3个复孔； 4.3.3 5%CO2，37培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测： a) 每孔加入20 L MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4h； b) 小心吸去孔内培养液； c) 每孔加入150L DMSO，使结晶物充分溶解； d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长570
8、nm的吸光值。4.3.4 数据处理及MTT增殖曲线绘制。平时考试注意事项一 以平常心态考试会发挥得更好。紧张时，闭眼，静一静。二 考前不给自己定科目考试分数目标会考得更好。三 审题要仔细要审完关键字要标识能减少失误四 遇到3-4分钟没思路的题可暂时放弃，演算很复杂的题可等容易简单的题做完后再做，切不可在一道题上消耗过多的宝贵时间。五 解题时只专心在本题上会大大提高正确率，一心二用易失误。六 以中等速度解题争取做一题对一题，做对比做完重要一万倍。七 会的题要保证全对，中档题要争取全对，不会的题争取不交白卷。低档题和中档题全做对就能考上一本！八 力争一次做对，不要指望有时间检查和修改。九 整洁清爽
9、的卷面，正确的书写，会赢得改卷老师的欢喜。十 解题时要由易到难，尤其是理综卷可看成是一门课。容易的题先做，拿到了基本分，心踏实了，反而会发挥得更好。十一 解题推演要一步一步地推，跳步骤可能导致失误丢分。十二 草稿纸演算标题号，书写要整齐，以便查错方便。十三 考过的科目不要再去想它，一门心思准备后面的考试。十四 晚上要早点休息，保证以最佳状态参加考试。十五 考试要带的东西要头天晚上准备好，以免遗漏，并放在最瞩目的地方。十六 考试前一天晚上把考试格言认真读一遍。高考和平时考试并无二样，所不同的只是高考内容广泛且综合，囊括了小学，初中，高中所学知识。高考主要考核每个考生十二年来所学知识的全面性，灵活
10、性和解题能力。统计过去历次高考情况，试题难易程度分配率大致排比为3:5:2，即一般难度的大约三成，中等难度的大约占五成，难度大点的所谓提高题约占二成。由此可见，只要能把中等难度以前的分数全都拿到，总分应该稳得600分。如果提高题再能拿到30%应有的分数，那总分就可得640650分了。所以一定要有信心和决心，不要被高考所吓倒。当然对待每道具体试题，还一定要认真细心，不能有丝毫马虎大意才行。接到试卷后不要急着答题，先简略的浏览下卷间的篇幅及夹层面或背面有无试题（防止答漏题）以及试卷的说明和要求（或注意事项）。还要留意答案的相应位置。审题和解题应是同步进行的，每道题在解题前都必须用几秒到几十秒的时间
11、先认真思考一下试题的意义和要解答的问题以及如何去解答。审题要注意试题里关键词和字的意义，特制一些棱模两可的词和字一定要区分清楚。有时一遍弄不懂的就要两遍三遍，知道弄懂题意后再动笔作答。审题要集中思想，专心致志，不要一心挂两头，瞻前顾后，分散精力，打乱思维。思考到那一题就好像全张试卷就只有这么一题。其他试卷题全都不存在似地。总之，思考试题时精力一定要高度集中，千万不可以思考了这一题又惦记着那一题。也不要怕审题耽误时间，常言道磨刀不误砍柴工。题审好答案明朗了，下笔要流利些，顺当些，时间省在里面不说，更重要的是避免了不必要的失分。解题次序应自第一题起向后依次逐题解答。这一题解答结束了才能解答下一题，
12、不能跳（挑）题或选题等乱解一通。这样容易出现答乱题或者在解这一题时大脑还同时想着那一题的混乱现象，最容易出差错。所以解题时为了集中思维，有秩序的解答，一定要按试题的顺序一题一题的解下去。这样才能避免精力分散，思维混乱，甚至答题张冠李戴等现象。解题时如遇到难度较大且繁杂，花费时间较多的试题或答到中途后面感觉棘手甚至答不下去的试题，可先暂放一下（记准要在答题处留足够多的答题位置）待试题解光后剩有时间的话再回头继续认真的去解，总之，不要被难题繁杂题耽误太多时间。作文主要是要审好作文题，固作文分数多，写走了题失分也多。所以在动笔写文章前一定要先审好作文题。根据所给条件弄清楚要怎么写，写些什么，写什么体
13、裁。必要时（时间许可）可将主题思想，分段及段落大意拟出来。所以作文的审题及准备工作费时较多。只有将主题思想扣准了，才能写出切入主题思想的文章，这才能得高分。选择题，改正题或只在答案里填写编号等一类试题，不仅要认真审题，而且还要一词一字地细细推敲，正确理解试题要表达什么意义，有时还要将待选的词或字代入试题，看选用哪个词或字去使试题的意义更完善，更恰当，这就是要选的正确答案。数理化的数字答案如不给计算器计算的话，就一定要在草稿纸上用笔算计算出来再填到答案里。千万不能图省事心算来计算数学答案，这很容易算错或记错。所有试卷的卷面都要整洁，字迹要清晰，让阅卷人看的清楚舒服。尤其语文卷（包括作文）的卷面更
14、要整洁，字迹更清晰工整，标点符号准确，少用错别字，潦草字或缺胳膊少腿的字。做好的试题不能轻易改动。整个试卷都解完了，如果还剩有时间只能用来解暂时丢来下未完成。其他已做好的试题不能轻易重审，更不能轻易的改动。因为试卷做完了，大多数人都认为任务完成了，万事大吉了，昏昏然了，思想马上就放松了。这时再回头看试题，眼睛都模糊了，字也看不清了，头脑好像被东西遮住似的，迷迷糊糊的。这样不经意的随便动笔，很容易让原来做对的题改错了，好好的得分题被改成失分题。所以一定要记住，千万千万不能将已做好的试题随意重新审查，随随便便改动。只能用这剩余时间重新审查丢下来未解或解完的试题以及确有把握确实做错的试题。就是这样子也不要急于动笔，可光将眼睛闭一会，让大脑稍事休息会，然后再重新振作精神，再通过认真审题，找出错在什么地方，应如何解或者如何纠正。千万千万不可以不通过认真仔细推敲而随意更改了事，这很容易出差错。所以在试卷做完后剩余有时间想再动笔，一定要慎之又慎，千万不可以草率行事。以上是我根据考场应试时容易疏忽以及心理活动方面几个应注意的地方，在这里提醒你一下，希望在考前一两天将这看几遍，将自己置身于考场的实际情况对比对比，让大脑留有深刻印象，以防在考场应试时犯别人或自己以往常犯的毛病。我想在临场应试时，只要注意这些地方，虽不能帮你多考多少分数，但是帮你少失些分应完全可以。
