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1、慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h更换为完全培养基，培养 48和72h后，分别收集富 含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为 DMEM（含10% FBS）贴壁细胞经培养生长增殖形成单
2、层细胞。3、菌株 大肠杆菌菌株DH5 a。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。三、包装细胞293T细胞的培养（一）293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的 出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉上清液，加入 PBS洗去残留的培养基；2、 加入0.25%勺胰酶，消化12min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除 胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。3、 细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 C预热的10% DMEM，用10mL移
3、液管进行吹打，较大力吹打68次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入450ul 10 % DMEM, 即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板 中计数。计数板上共4大格，每大格16小 格。计数时，4大格均计 数，总数除以 4 （得每大格细胞数），再乘以10 （10倍稀释）， 即 为实际n万/mL细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm , 5min。去掉上清。5、 根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%全培养基+20%FBS+10%DMSO，重悬细 胞，密度为3 x 10 将细胞溶液转移到 15
4、ml离心管中，并在其中加上 1ml新鲜的完全培养基，混匀后 离心，1000rpm , 5min。 去掉上清，加入 5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm培养皿。 将培养皿平稳放入 37C、5%CO2和95晰目对湿度的培养箱中培养。 第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。四、慢病毒包装和浓缩个/ml。6、 分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80 C超低温冰箱。7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检 测细胞存活率，观察细胞状态等。（二）293T细胞的传代当细胞生长到汇合率达到 80%90%寸需要对细胞进行传代操作，以
5、扩大细胞数量，维 持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3、 根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。4、将培养皿平稳放回 37C、5%CO2和95晰目对湿度的培养箱中培养。（三）293T细胞的复苏当细胞传代次数过多， 细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。1、设置温度为 3742 C的水浴。2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在12min使细胞溶液完全溶解。（一）质粒扩增构建好的慢病毒载体和
6、辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8间方可用以包毒。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去毒素抽提。（二）传293T细胞将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4度冰箱取出的0.25%夷酶，使其 均匀覆盖瓶底，置于 37度培养箱中3-5min ,取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部 晃下，加入3mL 37度水浴中预热的10% DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大 力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出 即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于 15mL离心管中，
7、取50ul混匀 后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul 10 % DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4 （得每大格细胞数），再乘以 10 （10倍稀释），即为实际 n万/mL细胞浓度。传代 当天记为第一天，若第二天进行转染，铺 900-1000万/T75 ;若第三天转染，铺 350-400万 /T75。每瓶T75加10mL 10 % DMEM培养基。转染当天观察细胞密度，80-90 %满即可进行转染。转染前无需换培养基。（三）做脂转 complexDMEM需在37度水浴中预热，L
8、ipoFiterTM转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需 摇匀。转染每瓶T75的complex成分如下：pspax10少gPMD2G10少g-TM 一一 pHBLV系列载体10四转染后6h换新鲜培液。注：LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiterTM说明书。（四）病毒收集转染后48和72h分别两次收集病毒上清（24h收集后置换新鲜培液），收集后以0.45 m 滤器过滤，于40 mL超速离心管中，4C, 72000g/min离心120分钟；（五）病毒重悬和保存500ul新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于 -80度甚至液氮保存。五、感染目的细胞（一）细胞准备5将状态良
9、好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1X10 /ml细胞，接种细胞数重因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%t接。（二）病毒感染1. polybrene 的选择：Polybrene:是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效 率，通常加入polybrene能提高感染效率 210倍。Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索；不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用110 g/ml 的围筛选合适的浓度，以 24h细胞无明显毒
10、性反应为佳，可参考文献并进行预实验摸索， polybrene 最常用的工作浓度为 68 g/ml。注： 1）汉恒生物的自产的 Polybrene产品，用户可用以进行辅助感染。提供的 Polybrene母液保存在-20 C （可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。4C可保存2周。2） Polybrene预实验请先以对照病毒进行摸索，部分细胞系 MOI及Polybrene的使用参见附表2。2. 感染细胞最佳MOI的测定MOI （ Multiplicity of Infection ,感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高
11、。对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293细胞，MOI=13时，80咐上的细胞均表达目的基 因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。3. 感染步骤按实验需要将细胞铺板（比如12孔板）。细胞数以第 2天密度约50婀宜。37 C培养过夜。对于Polybrene可施加的细胞：准备完全培养基和Polybrene混合物，Polybrene 终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加0.5 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于24孔板，其他孔板请相应调整体积。）对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入
12、下面步骤。感染前，从冰箱取出并在37C水浴中快速融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，轻轻 8字混匀。（具体加入的病毒数可参考附 表1） 37 C小体积感染4小时，4小时后补齐培养基至正常体积。（感染时培养基体积表格 如下）病毒小培养体积感染表培养皿类型2表面积/cm对应细胞培养液体积病毒感染对应细胞培养液体积96-well20.3cm100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well24cm1ml500ul6-well210cm2ml1ml60mm220cm4ml2ml100mm260cm10ml5ml度病毋感染4小时后补足至
13、拍养体积，感染 24小时后换液，腺病毋感染 2小时后直接换 液感染后第二天（约24小时），吸去含病毒的培养液， 换上新鲜的完全培养液， 继续37 C 培养。感染后48小时，对于带 GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率,对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株（详见下方）。注意：溶化的shRNA慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常 温可使病毒效价降低。4. Puromycin抗性筛选：Puromycin标准的施加终浓度围为110 g/ml ,不同细胞puromycin的工作浓度不同，请
14、查找相关文献（部分细胞参考用量见下图），另外请设不感染筛选对照（未经过病毒感染的野生型细胞），加入等量等浓度的 puromycin 。部分细胞puromycin参考值Cell lineSpeciesPuromycin ( ml)293Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3PC1.0Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1MCF-7Human1-3MDA-MB- XXXHuman1-3HepG2Human2HT1080Human1A549Human1.5H1299Human2Human embroyonic stem cells (Human ESCs)H
15、uman1更多Puromycin使用浓度更新中，详情请参考公司每2-3天换含puromycin的完全培养液一次，至不感染筛选对照组细胞被puromycin杀光，可进行以下两步操作（依照具体实验需要选择）。不挑取单克隆：将感染并筛选后的细胞进行传代，并继续施加puromycin进行维持性筛选培养。连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。挑取单克隆：将感染并筛选后的细胞挑选至少5个克隆进行细胞扩增，并继续施加 puromycin进行维持性筛选培养。扩增完毕后western blot或者QPCR检测目的蛋白的表达。挑取表达适中的稳定细胞株，连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。5. 感染悬浮细胞上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，
