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1、普利莱基因技术有限公司 电话 010-62053186 010-62027915 Email: Applygen Technologies I DocRev 1110Page 1 of 2Hifectin II 细胞转染试剂#C1505 1.2 ml in water (for 468 in vitro transfections in 24-well plates)常温运输，4C 1 年稳定，20C 长期保存。Hifectin II 在体转染试剂# C1505-10.1 ml in water (for 1230 in vivo transfections)常温运输，4C 1 年稳定，20C
2、 长期保存。特征： 有血清转染，可在细胞铺板前后立即转染 媲美 Lipofectamine 2000, jetPEI, FuGENE 等，毒性低 高效转染 siRNA、DNA、寡聚核苷酸 in vitro 转染细胞谱广，各种原代细胞和神经元 in vivo 动物转染，心肺肾肝脾等高效表达 描述：Hifectin II 是特殊修饰的聚乙烯亚胺(polyethylenimine)阳离子聚合物，与核酸结合形成复合物吸附于细胞膜表面后内吞入胞。在细胞内 Hifectin II 通过质子海绵效应缓冲内吞小体 pH 保护核酸免受降解，介导其转运到胞浆胞核高效表达。Hifectin II 允许有血清转染，在
3、细胞铺板的同时或铺板后后立即转染，其卓越的 in vitro 和 in vivo 转染能力堪比jetPEI、Lipofectamine 2000、ExGen 500、FuGENE、SuperFect 、Polyfect 等转染试剂，而且在多数细胞或组织器官的表达更佳。Hifectin II 具有宽泛的细胞广谱性，高效转染的在细胞有A497, A549,BHK,Caco-2, C-26, C2C12, C3H/10T, CHO, COS1, COS7, Sf9, HeLa, HEK293, HT-29, MCF7, NIH3T3, Jurkat, K562, RAW264.7, THP1, U9
4、37, PC12, L929, 5HSY-5Y, Vero,原代神经元、原代肝细胞、皮肤成纤维细胞、脐静脉内皮细胞、人单核/巨噬细胞、牛和人血管内皮细胞、人胚胎干细胞等。Hifectin II 具有优异的动物在体转染能力，介导基因在心肺肾肝脾等各种组织高效表达。质粒DNA质量：质粒高纯度OD260/2801.8无内毒素。可用内毒素清除剂(#D1501)清除内毒素。细胞准备：培养24h后，细胞胞体覆盖培养皿表面的5090%时均可转染，但我们推荐较高细胞密度80%转染为佳。原代细胞应控制在培养48h后细胞密度达到80%时转染。细胞密度低时阳性转染率并不低但毒性可能较明显，而且因细胞总数少蛋白表达量
5、不会很高。100%长满的细胞转化效率明显降低。如果表一或表二所列的volume of medium减半，且在转染48小时后换培养基，可进一步改善转染效率。细胞生长在10%血清培养基中，转染效果会更好。Hifectin II具有卓越的转染能力，允许细胞在铺板时或铺板后立即加入混合好的Hifectin II-DNA转染混合物，效果与贴壁后转染相似，但节省时间，适合高通量筛选。优化原则:不同类型的细胞对转染试剂和外源DNA的敏感性不同，同一细胞生长密度低时毒性会较明显。很多细胞按照列表推荐即可获得满意的结果，但一些细胞需要优化，目的是在无毒或低毒时获得最佳转染效率，且转染试剂和DNA用量最少。原则上
6、，几乎所有转染试剂优化必须考虑的参数是N/P ratio，即转染试剂的正电荷基团可中和核酸的负电荷磷酸基团的摩尔比率。在DNA量固定时，提高N/P值意味着增加转染试剂的量，可增加转染效率，但也会逐渐增加细胞毒性。优化操作：附表推荐的DNA量已经接近所列培养皿和细胞数的上限，一般无需增加。初次转染推荐N/P ratio=10 (附表灰色栏)。优化可在24孔板进行，可设定 N/P ratio为5、6、7、8、9、10、11、12等，参考附表推荐的DNA量，按公式计算Hifectin II用量：l Hifectin II = 0.3 NP ratio g DNA以24孔板1 g DNA为例，每增减1
7、个N/P ratio意味着Hifectin II用量增减0.3 l。 siRNA和寡聚核苷酸的优化同上。贴壁细胞转染 (#C1506，以24孔板为例，参见表一)1. 稀释1g DNA于100l生理盐水(自备，勿用其它替代) ，混匀。2. 取3.2l Hifectin II加至DNA溶液(加样顺序勿相反，否则降低转染效率)，立即振荡混匀，瞬时离心将液体甩至管底。3. 室温放置15分钟。4. 将100l转染混合物直接加至 1ml含10% 血清的完全培养基中。倾斜转动培养板混匀。含血清培养基能提高转染效率。转染前无需更换培养基。培养基体积为转染混合物的10倍。5. 培养2448小时，检测基因表达，或
8、1:10传代后加抗生素筛选。如果转染效率满意，转染后可不更换培养基，但因转染混合物稀释了培养基，也可转染48h后更换。表一 Hifectin II贴壁细胞加样和优化表Dilute DNA l of Hifectin IICulture VesselArea cm2SeedingCellsDNAgSalinel N/P=8 N/P=10 N/P=12volume of medium96-well 0.3 1.5 104 0.25 20 0.6 0.75 0.9 0.2 ml48-well 1 5 104 0.5 50 1.2 1.5 1.8 0.5 ml24-well 2 1 105 1 100
9、 2.4 3 3.6 1 ml12-well 4 2 105 2 100 4.8 6 7.2 2 ml6-well35-mm 10 4 105 3 200 7.2 9 10.8 4 ml60-mm25-cm2 28 8 105 5 400 12 15 18 8 ml100-mm75-cm2 75 2 106 10-15 1000 24-36 30-45 36-54 15 ml注：传代巨噬细胞如RAW 264.7的 DNA量参照表一加倍例如每一24孔用2g DNA，设N/P ratio=10。但原代巨噬细胞DNA量参照表一减半，设定N/P ratio=8，按公式计算转染试剂用量：l Hifect
10、in II = 0.3 NP ratio g DNA贴壁细胞在铺板时转染、或铺板后立即转染操作要点是：(1)用含血清的完全培养基洗涤消化的细胞，以去除消化酶。(2)用含血清的培养基制备铺板用的细胞悬液，细胞量要稍大些，以转染后24h细胞长8090%满，或转染后48h细胞完全长满为宜。(3)参照贴壁细胞转染步骤和表1制备Hifectin II-DNA转染混合物。 (4a)铺板后立即转染：将细胞悬液加到培养皿中，然后立即加入Hifectin II-DNA转染混合物，混合均匀。或者(4b)铺板的同时转染：将Hifectin II-DNA 转染混合物预先加到培养皿中，然后立即加入细胞悬液。(5)培养普
11、利莱基因技术有限公司 电话 010-62053186 010-62027915 Email: Applygen Technologies I DocRev 1110Page 2 of 22448小时检测基因表达。如果转染效率满意，转染后可不更换培养基，但因加入转染混合物导致培养基稀释，转染48h后更换培养基可使细胞生长更好。悬浮细胞转染 (#C1505)以 24 孔板 Jurkat 淋巴细胞、K562 为例。按照表二准备细胞和 DNA。初始转染推荐 N/P=10，随后可根据转染效率或细胞毒性设置 N/P=8、10、12 优化，按公式计算相应 Hifectin II 的量。注意 Daudi 和
12、Molt 4 转染 DNA 的量参见表二适当再增加 30%，然后按照 N/P=10 计算所需 Hifectin II 的量。悬浮细胞转染：参见贴壁细胞转染方法制备转染试剂和DNA 混合物，室温放置 20 分钟后直接加至 1ml 含 10%血清培养基的细胞悬液中。培养 2448 小时进行后续实验。表二 Hifectin II悬浮细胞加样和优化表Dilute DNA l of Hifectin IICulture VesselArea cm2CellNumbersDNAgSalinel N/P=8 N/P=10 N/P=12volume of medium96-well 0.3 3 104 0.3
13、 20 0.72 0.9 1.08 0.2 ml48-well 1 1 105 0.8 50 1.92 2.4 2.88 0.5 ml24-well 2 2 105 1.5 100 3.6 4.5 5.4 1 ml12-well 4 4 105 3 100 7.2 9 10.8 2 ml6-well35-mm 10 1 106 6 200 14.4 18 21.6 4 ml60-mm25-cm2 28 2 106 10 400 24 30 36 8 ml100-mm75-cm2 75 5 106 25 1000 60 75 90 15 ml注：计算公式 l of Hifectin II = 0
14、.3 NP ratio g DNA动物 in vivo 转染 (#C1505-1)DNA、siRNA 、寡聚核苷酸转染和优化相同。推荐初试转染N/P=10。按公式计算 Hifectin II 用量：l of Hifectin II = 0.02 NP ratio g of DNA表三 动物in vivo转染DNA和Hifectin II用量 (N/P=8)g, DNA 1 5 10 20 30 50 60 70 100l, Hifectin II 0.2 1 2 4 6 10 12 14 20表四 动物in vivo转染参照表注射部位 DNA Hifectin II 注射体积小鼠 尾静脉 50
15、 (40-70) g 10 l 400 l小鼠 腹腔 120 (100-200) g 24 l 1 ml小鼠 皮下 5 g 1 l 15 l小鼠 脑 2.5 g 0.5 l 5 l大鼠 静脉 160 (150-300) g 32 l 1-1.5 ml小鼠 脑 4 g 0.8 l 8 l小鼠总量DNA在50-75g之间较好，50 g表达增加不明显但毒性增加，超过100g部分动物可能死亡。注射混合物中DNA浓度应0.5g/ml。由于离子强度影响复合物形成，DNA和Hifectin II稀释于5% 葡萄糖溶液的效果比稀释于生理盐水好。另外有研究认为小鼠静脉注射用400l体积最佳。1. 50g DNA稀释于200l 5% 葡萄糖液( 自备，勿用其它替代)，振荡混匀。2. 稀释8 l Hifectin II于200l 5%葡萄糖，振荡混匀。3. 将稀释的Hifectin II加至DNA溶液 (顺序勿反)，立即振荡混匀。室温放置20分钟。4. 动物注射。2448小时左右处死观察。
