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1、 第四节 病毒包装和感染（磷酸钙法）WWJ材料：Cells：293T or 293FTpLL3.7 (with your like gene), PHR, VSVG（推荐用 CsCl 梯度离心或者试剂盒纯化的质粒） PB (10 mg/ml) NEAA0.45um 滤膜 步骤： 1. 所有病毒感染最关键的一步，确认你的 293T 细胞状态良好。2. 转染前一天将 293T 细胞铺于六孔板，当第二天细胞密度达到 60%左右即可进行转染。 由于 12h 要换液，建议把转染时间安排在早上 12：00 之前或晚上 21：00 之后。3. 在转染前不需要对 293T 细胞换液，不要用 PBS 洗。 4.
2、 按下列量比配置转染试剂体系：每个孔 pLL3.72ug; PHR1.5ug; VSVG1ug 要求质粒质量高。5. 培养箱内培养 1214 小时。6. 更换新的含 10%血清的 DMEM 培养基 2ml，加 NEAA(100X)20ul，继续培养至 48-54 小时。 （从转染开始计算时间） 。7. 收集的细胞上清，先经离心 6000rpm，5min，去除大的细胞碎片，再经过 0.45um 一次性滤器过滤（可选） 。8. 提前一天接目的细胞于六孔板，使第二天细胞密度为 50%。感染 时换液，加 1ml 该细胞的培养液。滴加病毒上清 1ml。9. 加 PB 2ul。离心 2500rpm,30m
3、in,室温。放入培养箱培养 24 小时，更换新鲜培养基并观察细胞的感染效率和细胞状态。 （如果部分细胞大量死亡，可以考虑减少感染时间，病毒上清量，或是降低 PB 浓度） 。10. 未用完的病毒 可以长时间保存在 80C，但会减低病毒滴度。如果是短时间（一两天之内）请保存在 4C 11. 病毒感染后 48h 观察荧光 。12. 感染后传代两次，才认为没有病毒危险，此时枪头和板才可丢弃。注意：1、整个病毒操作的过程要佩戴手套，收集含有病毒的废液和枪头等，最后用高压处理。 2、病毒包装和感染过程并不一定用新板。由于六孔板最后要丢弃，从节约角度，建议用旧板。3、由于六孔板要拿出细胞间离心，请做好防护工作。4、如果感染效果不显著，建议逐个采用以下方法： 感染体系翻倍，即每个孔 pLL3.74ug; PHR3ug; VSVG2ug 采用带有 neo 的 PLL3.7 质粒，用 G418 筛选。 二次感染。 离心病毒。 南普陀烧香。
