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1、第四部分 生物化学与分子生物学技术实践 高频考点突破 考点一 血红蛋白的提取和分离 1.蛋白质分离的依据 蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、 所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对 其他分子的亲和力等，可以用来提取和分离不同 种类的蛋白质。,2.方法及原理 （1）凝胶色谱法原理,提醒 凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果，但 直径过大造成洗脱液体积大，样品稀释度大；凝胶 色谱柱的高度与分离度有关。,（2）凝胶电泳法原理 凝胶电泳法的原理是不同蛋白质的带电性质、电 量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大 小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的 运动方向和运动速度不同。如下表：
2、,3.实验操作流程 红细胞洗涤离心去除血清 样品的处理 释放血红蛋白蒸馏水涨破 分离血红蛋白离心处理 粗分离透析（去除小分子杂质） 纯化凝胶色谱法进行分离和纯化 纯度鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相 对分子量,提醒 红细胞洗涤过程中，洗涤三次后，上清液 仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋 白；离心时转速要低，时间要短，否则白细胞等会 一同沉淀，达不到分离效果。 血红蛋白释放过程中，蒸馏水的作用是涨破红细 胞，甲苯的作用主要是溶解细胞膜。 为了加快干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝 胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需 12 h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝 胶中
3、可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。 滴加样品时，吸管管口要贴着管壁环绕移动，防 止破坏凝胶面。,对位训练 1.为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新 鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是 （ ） A.要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠 B.取血回来后，马上进行高速长时间离心 C.将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌 D.重复洗涤直到上清液呈红色为止,A,2.洗涤红细胞时，离心所用方法为 （ ） A.低速长时间离心 B.低速短时间离心 C.高速长时间离心 D.高速短时间离心,B,考点二 植物芳香油的提取 1.植物芳香油的基本知识 （1）成分：组成较复杂，主要包括萜类化合物 及其衍生物。 （2）
4、特点：具有很强的挥发性，易溶于有机 溶剂。 （3）应用：玫瑰精油是制作高级香水的主要成 分，能使人产生愉悦感；橘皮精油的主要成分是 柠檬烯，具诱人的橘香味，是食品、化妆品和香 水配料的优质原料。,2.玫瑰精油的提取流程 鲜玫瑰花+清水水蒸气蒸馏油水混合物 分离油层 除水 玫瑰油 3.玫瑰精油提取操作的关键 （1）安装装置顺序：从左到右，自下而上。 （2）温度计位置：温度计水银球的上限与蒸馏瓶 侧管的下限处在同一水平线上。 （3）冷凝管中的水流向：从下方进水，上方出 水，与蒸气流向相反。,加入NaCl,加入无水Na2SO4,过滤,（4）加热时防暴沸：垫石棉网，向液体中加入 几粒沸石或瓷片。 （5
5、）烧瓶内液体量：烧瓶容积的1/32/3。 （6）除水：加入无水Na2SO4后，放置时间可适 当延长些。 （7）温度及时间：为提高产品质量，要严格控 制蒸馏温度，可适当延长蒸馏时间。,4.橘皮精油的提取流程 石灰水浸泡漂洗压榨过滤静置再次过 滤橘皮油 5.橘皮精油提取操作的关键 （1）橘皮的处理：干燥后一定要用石灰水浸透， 时间至少10 h以上。 （2）压榨液的处理：可以先用普通布袋过滤除去 固体物和残渣，然后离心进一步除去质量较小的 残留固体物，再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮 油分离出来。,对位训练 3.植物芳香油易溶于 （ ） A.水 B.盐酸 C.碳酸 D.酒精,D,4.橘皮在压榨前，应用
6、下列哪种液体浸泡（ ） A.石灰水 B.水 C.酒精 D.盐酸,A,考点三 蒸馏、压榨和萃取三种方法的比较,提醒 水蒸气蒸馏要适当延长蒸馏时间，温度不 能太高。 用于萃取的有机溶剂必须事先精制，除去杂质。 压榨时原料必须要浸透，这样压榨时不会滑脱， 出油率高，不堵塞筛眼；使用石灰水充分浸泡原 料，破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑 脱，提高出油率。,对位训练 5.我们选择提取玫瑰精油的方法是 （ ） A.水气蒸馏 B.压榨法 C.水中蒸馏 D.萃取法,C,6.橘皮精油提取时一般采用 （ ） A.水中蒸馏 B.压榨法 C.水上蒸馏 D.萃取法,B,考点四 PCR扩增技术与体内DNA复制 1
7、.PCR的反应过程 （1）变性：当温度上升到90以上时，双链DNA 解旋为单链，如下图： （2）复性：温度下降到50左右，两种引物通 过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：,（3）延伸：温度上升到72左右，溶液中的四种 脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补 配对原则合成新的DNA链，如下图：,2.PCR扩增技术和DNA复制的比较,对位训练 7.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大 步，这三大步需要的温度依次是 （ ） A.92、50、72 B.72、50、92 C.50、92、72 D.80、50、72,A,8.引物的作用是 （ ） A.打开DNA双链 B.催化合成DN
8、A子链 C.使DNA聚合酶能够从引物的3端开始复制 D.提供模板,C,思维方法探究 思维误区警示 易错分析 蛋白质提取与分离的原理不清楚,纠正训练 使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质 量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为 图中 （ ）,B,知识综合应用 重点提示 通过“胡萝卜素的提取与鉴定实验”的考查， 提升“用文字、图表以及数学的方式等多种形式准 确地描述生物学方面的内容”的能力。,典例分析 如图为提取胡萝卜素的装置图，请 据图回答下列问题： （1） 的作用是 。 （2） 内加入的萃取液一般是 ， 原料在加入前，一般要进行 、 处理。 （3）该萃取过程采用的是水浴加热，其目的是
9、 。 （4）为了取得最佳萃取效果，萃取的时间应该 。,解析 图示装置为萃取装置，其中为冷凝管，其 作用在于降温，以防止加热时有机溶剂挥发，是 烧瓶，其内装有萃取剂，胡萝卜素的适宜萃取剂是 石油醚，为防止有机溶剂明火加热时引起燃烧、爆 炸，萃取时有必要采用水浴加热，而不用明火 加热。 答案 （1）冷凝管 降温，防止加热时有机溶剂 挥发 （2）烧瓶 石油醚 粉碎 干燥 （3）避 免使用明火加热引起燃烧、爆炸 （4）长,拓展提升 比较萃取装置与水中蒸馏装置 （1）两种装置中均具冷凝装置，但放置的方式和 作用不同。蒸馏装置比萃取装置多了接收瓶及牛角 管，且设有温度计以检测蒸气温度。 （2）蒸馏装置中，
10、烧瓶中装的蒸馏水可直接加热， 而萃取装置中装的是有机溶剂（萃取剂），故不可 直接加热（需水浴加热）。,变式训练 右图为胡萝卜素的纸层析 结果示意图，请据图回答问题： （1）该图所示的鉴定方法称为 。 （2）基线一般距底边 cm。 （3）A、B、C、D四点中，属于标准样品的样点是 ，属于提取样品的样点是 。点样 的要求是 。 （4）在图中的层析谱中，代表的物质是 ， 代表的物质是 。 （5）该层析的目的是 ， 而在“绿叶中色素的提取和分离”的实验中层析的 目的是 。,解析 该图为胡萝卜素的纸层析结果示意图，所示 的鉴定方法为纸层析鉴定法。基线一般在滤纸下端 距底边2 cm处，在基线上取A、B、C
11、、D四点，用最 细的注射器针头分别吸取标准样品和提取样品，在 A、D和B、C点上点样，点样应快速细致，在基线上 形成直径为2 mm左右的圆点，每次点完后可以用吹 风机吹干，注意保持滤纸干燥。图中和分别是 标准样品-胡萝卜素和分离出的其他色素及杂质。 答案 （1）纸层析鉴定法 （2）2 （3）A和D B和C 点样应该快速细致，圆点细小，每次点样时 滤纸都要干燥 （4）-胡萝卜素 其他色素和杂质 （5）胡萝卜素粗品的鉴定 提取并分离叶绿体中的 色素，探究色素的种类和颜色,定时检测 1.2008年5月20日民政部等制订汶川大地震遇难人 员遗体处理意见指出，无法确认遇难者身份的， 由公安部门提取可供D
12、NA检验的检材以便事后身 份辨认。事后的遗体辨认可借助于DNA杂交技 术，即从遗体细胞与死者家属提供的死者生前生 活用品中分别提取DNA，然后借助DNA杂交技术对 遗体进行确认。据此回答： （1）为了确保辨认的准确性，需要克隆出较多的 DNA样品。这需借助PCR技术。使用PCR技术的具体实验操作顺序是：,按配方准备好各组分 离心使反应液 集中在离心管底部设计好PCR仪的循环程序进 行PCR反应。 请写出图中方框的步骤： ， 该步操作应特别注意的问题是 。,（2）上表所示为分别从死者遗体和死者生前的生 活用品中提取的三条相同染色体上的同一区段DNA 单链的碱基序列，根据碱基互补配对情况进行判 断
13、，A、B、C三组DNA中不是同一人的是 。 （3）为什么从死者体细胞与死者家属提供的其生 前生活用品中分别提取的DNA可以完全互补配对？ 。,解析 PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技 术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制 出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因 为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究 的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破 案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等领域。 DNA杂交技术方法是从遗体细胞和死者家属提供的 死者生前的生活用品中分别提取DNA，在一定温度 下，水浴共热，使DNA氢键断裂，双链打开。若两 份DNA样本来自同一个体，
14、在温度降低时，两份样 本中的DNA单链通过氢键连接在一起，若不是来自 同一个体，则两份样本中的DNA单链在一定程度上 不能互补，DNA杂交技术就是通过这一过程对面目 全非的死者进行辨认的。,答案 （1）用微量移液器在微量离心管中依次加 入各组分PCR实验使用的微量离心管、枪头、缓冲 液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 （2）B、C （3）人体所有体细胞均由一个受精卵 有丝分裂产生，其细胞核中均含有相同的遗传物质,2.对血红蛋白（Hb）的研究结果表明，血红蛋白实际 上是由珠蛋白、原卟琳和二价铁离子（Fe2+）所组 成的结合蛋白质，由4条肽链各结合一个辅基即血 红素，O2结合于Fe2+上，血红
15、蛋白与氧疏松结合形 成氧合血红蛋白（HbO2），这种氧合作用在氧分压 高时容易进行，在氧分压低时易于解离。红细胞结 合和携带O2的过程并不影响Fe2+，也就是说不会使 之氧化为Fe3+。Fe3+无携带O2的能力。CO与Hb的亲和 力大于O2，结合成HbCO后不能分离，致使Hb丧失运 输O2和CO2的机能，这称为一氧化碳中毒即煤气 中毒。,（1）用凝胶色谱法分离血红蛋白时，待 接近色谱柱底端时，才用试管收集。血红蛋白因含 而呈现红色。 （2）要使血红蛋白从红细胞中释放出来，可选用 的方法是 。 （3）红细胞具有运输氧的功能，是因为 。 （4）亚硝酸盐为强氧化剂，进入人体后，可使血 红蛋白失去运输
16、氧的功能，导致人体组织缺氧，其 可能的原因是 。,解析 用凝胶色谱法分离血红蛋白时，血红蛋白因 含血红素而呈现红色，待红色区带接近色谱柱底端 时，才用试管收集。将红细胞置于蒸馏水中，加 40%体积的甲苯，搅拌使红细胞破裂并释放出血红 蛋白。红细胞中的血红蛋白与氧在氧分压高时容易 结合，在氧分压低时又容易分离。亚硝酸盐可将血 细胞中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，从而使 其失去与氧结合的能力。 答案 （1）红色区带 血红素 （2）将红细胞置 于蒸馏水中，加40%体积的甲苯，搅拌使之破裂并 释放血红蛋白 （3）红细胞中的血红蛋白与氧在氧分压高时容易 结合，在氧分压低时又容易分离 （4）亚硝酸盐 可使血细胞中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白,3.PCR（聚合酶链式反应）技术
