《（优质医学）病毒感染性疾病的实验室诊断》由会员分享，可在线阅读，更多相关《（优质医学）病毒感染性疾病的实验室诊断（54页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、病毒感染性疾病的实验室诊断,1,病毒（Virus）是结构最简单、体积最小的微生物。病毒感染十分常见，约70%80%的传染病由病毒感染所引起。迄今已证实500多种病毒对人有致病性，其中不少病毒危害极大，如最近流行的SARS病毒。因此尽快获得病毒的实验诊断，对控制病毒的转播、疾病的诊断和防治具有重要的意义。,2,病毒性疾病实验诊断的一般原则是特异、敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒；然后根据可疑病毒生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断的方法。目前病毒感染的检查主要依靠经典的方法和近来发展起来的分子生物学等方法。前者主要包括病毒分
2、离培养、鉴定及血清学实验；后者主要是核酸杂交与PCR及现代免疫学技术。,3,病毒学检验,病毒分离培养 病原学诊断 形态学检测 分子生物学技术病毒核酸 补体结合试验 中和试验 血清学诊断 血凝抑制试验 间接免疫荧光检测 酶联免疫吸附试验,4,一、标本采集与运送 （一）标本的采集要从临床标本中成功地分离出病毒，很大程度上取决于标本的恰当采样和处理，为了保证标本质量，应注意以下问题： 1采样时间 尽可能在发病的初期，急性期或患者入院的当天进行，越早越好，最好在治疗之前。疾病后期体内产生免疫力，病毒量减少或消失。,5,2标本种类的选择 根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒的种类，选择相应
3、部位采取标本，处理标本时要考虑病毒的生物学特性。常见分离病毒标本的选择见书P64表4-2。（1） 心脏疾病（2） 中枢神经系统感染（3） 先天或新生儿感染（4） 胃肠道疾病（5） 呼吸道感染,6,3常见标本的采集方法（1） 血液：以无菌手续抽取抗凝10ml， 抗凝剂可选用100u/ml肝素钠。为 了血清学检查的需要，应抽取另一 管5ml血液，不抗凝送检。（2） 脑脊液：以无菌手续抽取脑脊液 12ml，置无菌试管内，在冰浴中,7,应立即送检。4可存放72h。 （3）宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分 泌物，将拭子置运送液中；如无病 损部位，则清理宫颈口粘液，将拭 子伸入宫颈约1cm停留5秒以上取 出
4、，置运送液中4冰浴立即送检。,8,（4） 粪便标本：取24g粪便标本在无 菌的容器中，加810ml运送液立 即送检。 （5） 含漱液：可用无菌生理盐水，让患 者含漱几次取得，与运送液等量混 合。,9,（6） 喉拭子：用生理盐水湿润的拭子采 取咽喉部表面，置运送液中，注意 避免唾液污染。（7）尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸 入尿道4cm轻轻转动23次，以获 得较多的上皮细胞，取出后置运送 液中。（8）尸检标本：应在死亡后尽早采取， 采集各种器官时要分开使用器械和 容器。,10,（二）标本的运送和保存 标本采集后注意无菌、冷冻、保湿、立即送检。 分离培养病毒的标本要尽快送到实验室处理和接种。如不能
5、及时送检，可在4冷藏数小时，如需较长时间保存则应置-70。放置在-20，病毒容易灭活，冻存液中需加入甘油或二甲亚砜等作保护，避免反复冻融使病毒灭活。,11,为了抑制细菌生长通常在病毒传送培养基（VTM）中加入抗生素如青霉素100U/l和链霉素100g/ml，为了抑制真菌的生长加入2.5g/ml二性霉素B或40g/ml制霉菌素。,12,二、病毒的分离与鉴定 （一）病毒分离和鉴定的一般程序 病毒分离和鉴定的一般程序见书P66 图4-1 （二）病毒的分离 病毒是专性细胞寄生，需要在活细胞或动物体内才能得到分离。选择何种动物或细胞来分离，应根据临床感染的症状和流行病学资料，推测可能的病毒种类，选择相对
6、敏感的动物和细胞来分离标本中的病毒。,13,1.组织培养 （1）概念 将人或动物离体的活组织或分散的活细胞，在实验室的试管或培养基中，模拟体内的生理条件使之生存和生长，称之为组织培养。 （2）组织培养的类型 A 器官培养：如气管、肠段。器官保存了原功 能，用于分离某些有器官特异性的病毒。 B 组织块培养：如肝组织块培养肝炎病毒。 C 细胞培养（单层细胞培养）：现使用广泛的 组织培养技术。,14,（3）细胞培养的种类和方法 根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同可分为三类： 1 原代和次代细胞培养 离体的新鲜组织或器官，机械处理 胰蛋白 洗涤 吹打 酶消化 加入营养液 单个细胞悬液 1-3次
7、 细胞计数 、调整细胞浓度 分装培养 生长 瓶内培养 形成单层细胞，称为原代细胞培养,15,胰酶消化 转种新的培养瓶 形成单层 细胞，称为次代细胞培养 2 二倍体细胞株 原代细胞多次连续传代后仍保持二倍体染色体特性（即含23对染色体），称之为二倍体细胞。传代细胞寿命一般为4050代，大多数为成纤维细胞,如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。,16,3传代细胞系 来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程的变异细胞。细胞增殖特征和染色体均类似于肿瘤细胞。不宜用于疫苗的制备，常用于病毒的分离和鉴定。 （4）组织培养的特点 优点：A来源广；B不受机体免疫因素影响，个体差异小，敏感范围广；C.易于观察病变；D
8、.可用于病毒的分离、鉴定、疫苗的制备；E.易管理，相对比较经济。 缺点：条件要求高，必须要有细胞培养的条件。,17,2. 鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。 （1） 常用接种部位和用途 38-39 新鲜受精卵 5-13天,卵黄囊接种 羊水腔接种 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种,18,卵壳,气室,尿囊,绒毛尿囊膜,卵黄囊,卵白,羊膜,羊水囊,19, 卵黄囊接种：用于流行性脑炎病毒分 离 羊水腔接种：用于流感病毒、副流感 病毒的初次分离 尿囊腔接种：用于流感病毒、腺病毒、 腮腺炎病毒分离 绒毛尿囊膜接种：用于痘病毒、疱疹 病毒分离,20,（2）鸡胚接种的特点 优点：
9、A.鸡胚是一个整体，可有多种 接种途径； B.可收获大量病毒； C.鸡胚本是无菌无病毒的，对 接种病毒不产生抗体； D.来源广，操作简便。 缺点: A.易感病毒较少，应用较局限 B.反复用鸡胚传代，病毒毒力 可下降,21,3. 动物接种,（1）常用动物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、 猴等（2） 接种途径： 呼吸道病毒，如流感病毒，滴鼻接种3周龄新生小鼠肠道病毒，如柯萨奇病毒，腹腔接种乳鼠（一日龄）乙肝病毒，静脉注射猩猩嗜神经病毒，如乙脑病毒（用3周龄小鼠）、狂犬病毒（用家兔），颅内接种,22,（3）接种后观察应每日至少两次，必要时 每隔24小时观察一次。根据实验目 的的不同，观察不同的反应情况。
10、（4）动物接种特点 优点：A.可以按照不同途径分离鉴定 病毒，可模拟人类感染途径 B.可用于疫苗的筛选、制备 C.可用于制备抗血清 D.操作简便，对环境要求低,23,缺点：A.可自然带毒或隐性感染，影响 结果的观察 B.存在个体差异 C.敏感病毒较少，或有些病毒感 染后不出现明显症状，不宜观 察 D.不经济，难管理,24,（三）病毒的鉴定 1.初步鉴定 根据临床症状、流行病学特点、标本来源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特性、理化性质，可初步确定病毒属于何科何属。（1） 动物感染范围及潜伏期 病毒感染动物的范围、发病的潜伏期有差异。如柯萨奇基B组病毒对新生乳鼠致病，对成年小鼠不致病；小鼠脑
11、内接种乙脑病毒，潜伏期一般为4天，少于4天发病则可能为非乙脑病毒引起。,25,（2）对鸡胚的敏感性 不同病毒对鸡胚不同接种途径敏感性不同。 直接法：如观察绒毛尿囊膜是否有病灶 间接法：尿囊液、羊水做血凝抑制试验等,26,（3） 病毒在细胞培养中的表现, 细胞代谢类型改变：细胞代谢产酸可 导致培养液pH指示剂呈黄色，病毒 增殖抑制了细胞代谢，使培养液不变 色或变红。但腺病毒不抑制细胞代谢， 反而促进糖酵解增加产酸。 细胞形态学变化 由病毒增殖所引起的细胞变化称为 细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)。,27,A. 细胞溶解，细胞培养液中出现空斑, 如肠道病毒； B. 细胞融
12、合形成多核巨细胞，如疱疹病 毒；C .细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，如腺 病毒；D .胞浆内或核内出现嗜酸性包涵体，如 狂犬病毒：E .不出现细胞病变现象。,28, 空斑或蚀斑（plaque）形成试验： 空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起。不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定。,29, 干扰现象： 一种病毒感染细胞后，可以干扰以后进入的病毒的增殖。利用此现象鉴定不引起形态学变化的病毒。如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感型病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞
13、吸附作用。,30, 红细胞吸附及吸附抑制试验： 红细胞吸附现象的产生是由于病毒在细胞膜成熟时，将其血凝素插入细胞膜，使受染细胞吸附红细胞，是病毒增殖的指标。该现象可被相应的病毒特异性抗体所抑制，称为红细胞吸附抑制试验，可用来鉴定病毒。,31,（4） 理化性质的测定 病毒的大小和形态：可用电镜观察病毒 的大小和形态。 核酸类型鉴别及序列测定：利用5-溴- 2-脱氧尿苷（BUDR）抑制DNA复制的 特性，在细胞培养液中加入该物质，可 抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞 病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用， 以次判断病毒核酸类型。也可对病毒特 异序列或全序列的碱基排列测定或DNA 杂交、DNA-
14、RNA杂交来鉴定病毒。,32, 耐酸试验：肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。 乙醚敏感试验：病毒外周如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。,33,2 最后鉴定血清学试验 在初步鉴定的基础上，对已分离出阳性结果需选择适当的血清学方法对病毒分离株作最后鉴定。血清学方法鉴定是将分离到的病毒和已知病毒的参考血清作中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等。由于分子病毒学的发展，病毒的最后鉴定还应包括分子生物学方法的鉴定，它还能检出不产生细胞病变的那些病毒。,34,（1） 中和试验：是将病毒与特异性
15、抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养和活的机体内不出现病变的试验。常用细胞培养进行中和试验。,35,方 法： 固定病毒（100TCID50），稀释血清，测Ab效价。两次效价相差4倍以上有诊断意义。 TCID50：50%组织细胞感染的病毒剂量(50%Tissue cell infective dose TCID50) 固定血清（1：20或1：40），稀释病毒， 求中合指数。,36,中和指数50为阳性，有意义 中和指数9为阴性，无意义 中和指数1049，为可凝。 中和试验较复杂和费时，多用于V的鉴定和流行病学调查，对临床诊断价值不大。 （2）血凝与血凝抑制试验 某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可抑制血凝现象的发生，是为血凝抑制试验。可作为病毒型别确定的依据。 （3）补体结合试验,37,三、病毒感染的快速诊断 （一）、病毒的形态学检查
