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1、玉米浆补料和扩大发酵对启动乳酸生产的影响摘要：从Tunisian lben中分离的3株乳酸菌（Lactococcus ssp. lactis var. diacetylactis, Lactococcus ssp. lactis cremoris and Lactococcus ssp. lactis var. lactis）生长在恒定pH值的玉米浆培养基中，搅拌发酵启动乳酸生产。控制pH值的匀浆碱的搅动速度应低，因为它会影响乳酸的增长。从20L至400L的发酵罐，其叶轮外缘速度应低于150cm/s。添加葡萄糖的玉米浆补料和分批补料最多能增加1010 cfu/mL的产量。在发酵过程中消耗的葡萄
2、糖转化为乳酸和细胞。前补料，乳酸菌Lactococcus ssp. lactis var. diacetylactis的最大特征生长率比接种时的细胞数量增长了2040倍。后补料，葡萄糖的消耗速率保持不变，但是特征生长速率下降了，细胞数量只增加了2倍。1 简介适时开始发展的发酵乳品研究，使我们能够获得高品质的统一产品。乳酸菌（LAB）的功能是双重的：产生的乳酸能酸化牛奶和构成最终产品味道的特色组成部分。此外，乳酸菌产生的细菌素能杀灭多种致病菌。世界上大部分地区都生产发酵乳，其发酵乳中的乳酸菌种类是不同的。Lben是世界上最古老的发酵乳，尤其是在阿拉伯国家，其乳酸菌种为优势种。乳酸工业起步时，3株
3、乳酸菌从Tunisian lben中筛选出来，因为其乳酸生产的高产率和高得率，还有其在lben生产中的独特气味和味道。玉米浆和酵母提取物被用作乳酸菌生产的氮源。搅拌发酵在乳酸工业起步时的报道很少，其数据仍然是工业秘密之一。发酵按比例放大的问题与发酵液体的性质、生物体的代谢反应有关。乳酸菌发酵按比例放大的最小体积要求能快速转移大量物质，特别是匀浆和在发酵过程中控制pH值的碱，以减少对碱产生的抑制作用。控制pH值为6能增加乳酸菌细胞密度最多至1010cfu/ml ，还能提高冷冻干燥后的活细胞。然而，搅动引起的剪切力能影响培养的微生物，特别是微生物絮凝物或链状细菌。在目前的研究中，对初始玉米浆浓度、
4、初始接种量和按比例放大搅拌发酵生产乳酸菌的影响进行了调查。2 材料与方法2.1 菌种和预培养条件本研究中使用的乳酸菌是从Tunisian lben中分离的。这些菌株鉴定为Lactococcus ssp. lactis var. diacetylactis (SLT 6), actococcus ssp. lactis cremoris (SLT 7) 和Lactococcus ssp. lactis var. lactis (SLT 10)。这些菌株保存在-180甘油中。乳酸菌的生长、活菌计数（菌落形成单位：cfu）和保存的培养基是M17琼脂培养基。从M17琼脂培养基中挑取菌落接种于锥形瓶80
5、%装液量的预培养培养基中。预培养培养基是把乳糖换成20g/L葡萄糖的M17肉汤培养基。30静态孵化16h。2.2 发酵操作在30，20L和400L搅拌发酵罐（Biolafitte，法国）中进行分批发酵和补料发酵。搅拌系统是一个桨状涡轮。20L和400L发酵罐搅拌叶轮的直径分别为10cm和26cm。在20L和400L发酵罐中乳酸启动生产的玉米浆培养基配方是：分别含8、12和20g/L酵母提取物，0.5 g/L磷酸氢二钾和0.25 g/L硫酸镁的液体玉米浆。消泡剂只在灭菌时加入，因为减少通风和较低搅拌速率不能减少发酵中泡沫的产生。在以下两种情况下添加葡萄糖：()20g/L灭菌，当温度降低到30时添
6、加，以避免美拉德反应；()流加时20g/L添加。乳酸菌在500mL和3000mL锥形瓶中预培养到对数生长期，按2.5%（v/v）接种量添加到玉米浆培养基中。发酵的温度保持在30。在添加10N NaOH的20L发酵罐和添加10N KOH的400L发酵罐中，控制pH值为6.5。我们的初步实验表明，在乳酸菌的生产和冷冻干燥过程中使用NaOH比KOH更好控制pH值。2.3 分析方法在预培养和发酵中分析生物质（OD和活菌）、葡萄糖含量和乳酸含量。发酵液离心15min，10000g。上清液用于葡萄糖和乳酸分析，以及光密度测量。测量OD540，用于估计乳酸菌细胞含量。活菌计数法是用来确定乳酸菌样本在M17琼
7、脂培养基上形成菌落的数量。取0.1mL稀释样本在琼脂表面涂布，然后培养至菌落形成，并计算菌落数（cfu/mL）。用YSI modle 2700选择分析葡萄糖和乳酸酶。3 结果与讨论3.1 玉米浆初始浓度和分批补料的影响初步实验表明，玉米浆、葡萄糖分批补料及控制发酵过程的pH值有利于提高20L发酵罐中乳酸菌的最终细胞产量。用锥形瓶发酵产乳酸时，培养基装液量不能过多，因为酵母提取物很昂贵。为了用玉米浆代替酵母提取物，培养基需添加2倍玉米浆浓度。乳酸菌生长和产乳酸最方便显然是添加酵母提取物。时间（h）OD (U/mL)葡萄糖(g/L)乳酸 (g/L)图1 乳酸菌Lactococcus ssp. la
8、ctis var. diacetylactis在20L发酵罐批生产中，OD()、葡萄糖()和乳酸()随时间变化图 (添加玉米浆8 g/L)表1在20L发酵罐分批和流加发酵(150rpm)中，乳酸菌产量受初始玉米浆含量的影响发酵玉米浆(g/L)葡萄糖(g/L)菌株最终cfu/mL分批820SLT 65.2109820SLT 74.52109820SLT 108.3108流加1220 + 20SLT 69.41091220 + 20SLT 76.8109时间 (h)葡萄糖(g/L)乳酸 （g/L）OD (U/mL)图2 乳酸菌Lactococcus ssp. lactis var. diacety
9、lactis在20L发酵罐批生产中，OD()、葡萄糖()和乳酸()随时间变化图 (添加玉米浆12g/L)在一批发酵中，pH值的调节需要大量NaOH，高乳酸产量与葡萄糖的消耗、乳酸菌的生长是相关联的（图1）。不考虑延滞期，乳酸菌在最初的2小时内生长很缓慢。然后，葡萄糖消耗率增长迅速，从而产生乳酸。在对数生长期，乳酸产量相对于葡萄糖消耗保持在0.9g/g以上。早去乳酸产量下降是因为低玉米浆浓度导致氮源限制。事实上，后期发酵中葡萄糖消耗提高的是OD U/mL而不是cfu/mL（表1）。随着玉米浆的补充，流加葡萄糖4小时后乳酸菌持续生长，最终cfu/mL也持续增长(图2，表1)。然而最后2小时，OD值
10、增长很大，但cfu/mL则相反，原因是氮源限制和高浓度葡萄糖的影响。3.2 按比例提高叶轮边缘速度从实验室规模扩大到产业规模需保持足够的水动力条件10。水动力条件必须允许物质在发酵罐中快速转移，特别是KOH迅速扩散与中和乳酸菌产生的乳酸。此外，搅拌加快了葡萄糖从细胞到培养基中的转移。总之，据观察在发酵初期，搅拌影响这些乳酸菌的生长和活菌数，特别是搅拌速率在400L发酵罐中高于100rpm和在20L发酵罐中高于150rpm时。最适混合水平必须折中考虑物质的大量转移和乳酸菌链的低剪切力。恒定液体剪切力速率的扩大，要求在生物反应器中分散性良好，并保持乳酸菌的自然形态。在恒定叶轮边缘速率(NDi)几何
11、相似的发酵罐中，叶轮转速降低时，发酵罐体积增大9，10。据观察，乳酸生物量越高，在低于150rpm搅拌速率的20L发酵罐中的冻干乳酸菌得率也越高。叶轮转速与叶轮边缘速度(NDi)在低于150cm/s时相一致。在400L发酵罐中，叶轮转速75rpm与叶轮边缘速度低于150cm/s时相一致(表2)。因为剪切力的原因，叶轮转速越高，对发酵罐中生物量生产的影响越大，冻干乳酸菌活菌得率也越低。这些数据表明，在400L发酵罐中搅拌速率为125rpm，能获得高cfu/mL和低OD U/mL，因为乳酸菌链对剪切力敏感。事实上，高叶轮转速产生较短的乳酸菌链和较小的乳酸菌细胞，这些细胞在冻干后的存活率很低（数据未
12、显示）。相比真菌和细菌菌丝体能耐受相对较高的叶轮边缘速度（250500cm/s），链式乳酸菌似乎对搅拌非常敏感。增加KOH流量能减少混合时间，其所需混合的叶轮转速也能减少。表2 搅拌对乳酸菌(SLT 6)在400L发酵罐中补料分批发酵的影响参数搅拌(75 rpm)搅拌(125 rpm)葡萄糖消耗(g/L)31.630.42初始生物量(OD U/mL)0.450.408初始生物量(cfu/mL)2.341081.33108最终生物量(OD U/mL)9.168.3最终生物量(cfu/mL)1.3210101.7610103.3玉米浆补充量和初始接种量对400L发酵罐补料发酵的影响通过乳酸菌研究了
13、在相同预培养和混合条件下，玉米浆浓度对活菌数的影响。玉米浆在补料期间的添加量对培养乳酸菌的影响，与以前在20L发酵罐中补料培养乳酸菌的相同。事实上，乳酸菌在400L发酵罐中培养，最终的活菌数是12g/L玉米浆的2倍，而在20g/L玉米浆补料分批培养后，活菌数可达12g/L玉米浆的3倍（表3）。表3 在400L发酵罐(75rpm)中补料分批发酵，初始玉米浆浓度对乳酸菌产量的影响菌株玉米浆(g/L)初始(cfu/mL)分批补料发酵(cfu/mL)最终(cfu/mL)SLT 6126.61075.171099.37109SLT 7128.341083.61097.3109SLT 6202.34108
14、4.561091.321010SLT 7202.61085.751091.571010SLT 10202.181086.41091.431010接种量少，相对的初始细胞数低于108 cfu/mL，分批培养的生物量达不到5109 cfu/mL。当初始接种量高于108 cfu/mL时，3种乳酸菌在发酵末期达到1010 cfu/mL的时间提前了。分批发酵后，乳酸菌SLT10的细胞数量增加了2倍，乳酸菌SLT6和7的细胞数量增加了3倍。乳酸菌SLT6在400L发酵罐中用优化玉米浆培养基补料分批发酵的结果如图3所示。在前、后补料阶段，葡萄糖消耗几乎保持了恒定，乳酸生物量的增加在2个阶段。补料分批发酵前的
15、动能增长高于后期的发酵。补料分批发酵前，消耗的葡萄糖转化成乳酸和细胞。最大特定生长速率大约为1/h，细胞数量增长了40倍（从2.34108cfu/mL至4.56109cfu/mL）。乳酸产率为3.45 g/L，乳酸产量与葡萄糖消耗相关，最高达0.9g/g。事实上，如果没有抑制作用或氮源限制，乳酸特定产率是特定生长率的线性函数，因为乳酸菌发酵产的乳酸是能量供应最终产物。图3 乳酸菌Lactococcus ssp. lactis var. diacetylactis在400L发酵罐批生产中，OD()、葡萄糖()和乳酸()随时间变化图 (添加玉米浆20g/L)葡萄糖(g/L)乳酸 (g/L)OD (U/mL)时间 (h)
