基因工程学终版

《基因工程学终版》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程学终版（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、基因研究三阶段：染色体遗传学阶段：从细胞染色体水平上进行研究 分子生物学阶段：从DNA大分子水平上进行研究 反向生物学阶段：直接从克隆目的基因出发，研究基因功能及其与表型关系基因：是DNA上某一特定的可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列0基因的特点：1，不同基因的具有相同的物质基础 2，遗传密码通用 3，基因可切割 4，基因可转移 5，多肽与基因之间存在相应关系 6，基因通过复制将遗传信息遗传给下一代。基因工程：在体外将核酸分子进行剪切，重组，连接然后插入病毒质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定的繁殖。基因工程的特点：1，跨物种

2、性，外源基因在另一生物细胞内繁殖 2，无性扩增，外源基因DNA在寄主细胞内大量扩增和高水平表达。核苷：由一个戊糖和一个碱基缩合而成的核苷酸：由核苷中的戊糖的烃基与磷酸基缩合而成磷酸酯，它是构成核酸基本单位顺反子：是一段核苷酸序列，或者说相当于一个基因的DNA或RNA单元，它编码一种完整的多肽链编码区：含有大量的可以被细胞质中转译机器阅读的遗传密码，包括起始、终止密码子非编码区：对于基因遗传信息的表达是必要的，但它们不会被转译成多肽序列启动子：位于基因5端上游外侧紧挨转录起始点的一段非编码区的核苷酸序列，功能-引导RNA聚合酶同基因正确部位结合终止子：位于基因3端下游外侧一段非编码的核苷酸序列，

3、功能-具转录终止信号功能真核生物和原核生物编码基因产物区别：真的基因都是以单顺反子形式存在，因此它们编码的也是单基因产物 原的基因是以多顺反子的形式存在，意指一个mRNA分子编码多个多肽链，这些多肽链对应的DNA片段则位于同一转录单位内，享用同一对起点和终点分子探针：是一种带有高比活性放射性标记的并且只能同目的基因特定序列作碱基配对RNA或DNA分子，它们同目的基因杂交后，可通过放射自显影技术检测出来，从而达到分离基因的目的分离基因的方法：包括生物化学和遗传学方法，核酸杂交以及核酸内切限制酶切割法等。一般用基因克隆的技术和PCR技术。移动基因：又叫转位因子，由于它可从染色体基因组上的一个位置转

4、移到另一个位置，甚至在不同的染色体间跃迁，因此称为跳跃基因，又分为插入序列、转位子、复合转位子插入序列：分子量小于2000bp的（IS因子）断裂基因：编码序列不连续的间隔基因RNA剪辑：先转录成初级转录物，然后经过删除和连接，除去无关的DNA间隔序列的转录物，变成了成熟的mRNA分子，它从细胞核中输送到细胞质，再转译成相应多肽链，这种间隔子的删除和表达子的连接最后形成mRNA的过程，称RNA剪辑假基因：这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同。但都不能合成出功能蛋白质的失活基因。其是基因一退化形式。因为在某一阶段存在着伤及基因表达的一种或几种缺陷基因工程主要研究内容：目的基因的获取 重

5、组体的制备 重组体的转化 克隆鉴定 目的基因表达基因工程应用：A在农业生产中应用：提高植物光合作用效率 a.提高CO2固定率 b.提高光能吸收率耳环转化率 提高豆科植物的固氮效率 转基因植物 B 转基因动物 C在医药上应用 用转基因植物或动物生产药物与 用微生物生产药物 技术设计高效特异性生物制剂 研制疫苗 基因诊断 法医鉴定 基因治疗 D在环境保护中：检测水污染 生物降解电泳种类：琼脂糖凝胶电泳，用于3000-50000bpDNA片段分离。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，用于1-1000bpDNA片段分离。 脉冲典藏凝胶电泳，用于分离条染色体。电泳的原理：带电荷的分子在电场中会以一定的速度移向适当的电

6、极。移动速度称为电泳迁移率，电泳过程中，相同分子量，闭合环状最快，线性次之，展开环状最小。回收DNA：在65下将LMP熔化，加过量酚抽提，离心得含DNA的上清液。核酸分子杂交：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当他们混合在一起时，其相应的同源区段会退火形成双链的结构，如果彼此退火的核酸来自不同生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。核酸分子杂交步骤： （1）将核酸样品转移至固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹转移。（2）将具有核算印迹的滤膜筒带有放射性标记DNA或RNA探针进行杂交。核酸印迹转移法：（1）电泳凝胶核酸印迹法（2）斑点印迹法（3）狭线转移法（4）菌落印

7、迹法（5）噬菌斑印迹法复制子：每个基因组筒仓只有一个复制起点，这样的DNA分子称为复制子。细菌转化：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传性状特征的改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做给体菌株，而接受转化的菌株成为受体菌株。感受态细胞：细菌在进入一周感受态的特殊生理状态时才能捕获外源DNA。大肠杆菌的转化：1，将正在生长的大肠杆菌在0下加入到低渗的NaCl中，造成细胞膨胀。2，与外源DNA形成黏附在细胞表面的复合物。3，42下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞所吸收。4，在培养基中生长一段时间，使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转

8、化因子。基因的化学合成方法：寡nt片段化学合成方法：1.磷酸二酯法 2.磷酸三酯法 3.亚磷酸三酯法 及在后者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。研究DNA与PRO相互作用方法：凝胶阻滞试验 DNase I足迹试验 甲基化干扰试验体内足迹试验PCR引物：1，常用12-24bp 2,CG含量一般4060 3，同一碱基连续出现不超过5个 4，避免出现引物二聚体，发夹结构PCR基本原理是什么，用PCR扩增某一基因需预先得到什么？双链DNA分子加热分离成两单链，在DNA聚合酶作用下以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的固相dNTP合成新生的DNA互补链，因为DNA聚合酶需一小段双DNA来启动新链合

9、成，所以新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在退火位置所决定粘性末端：含几个nt单链的末端，分2类型：（1）5端凸出（2）3端凸出同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同Hind3和 Hsu I 不完全同裂酶：识别位点相同但切点不同Xam I和Sma I同尾酶：识别序列不同但能切出相同的粘性末端BamH I, Bgl 2, Bcl I, Xho 2,影响ligase效率的主要参数：反应温度（最佳37，实用温度4-15） 连接酶浓度（平末端：1-2个单位，粘性末端：0.1个单位） 反应时间 ATP浓度（变动范围）插入片段与载体分子的摩尔比值(最佳3:1)影响核酸内

10、切酶活性的因素：1，DNA纯度 2，DNA的甲基化程度 3，酶切消化反应的温度 4，DNA的分子结构 5，缓冲液体外连接DNA片段的方法：用DNAligase连接具有互补粘性末端的DNA片段 用T4DNAligase将平末端的DNA片段连接起来，或是有末端脱氧nt转移酶给具有平末端的DNA片段加上PolyAPoly(dT)尾巴后，再用DNAligase将他们连接起来。 先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或街头，形成粘性末端之后再用DNAligase连接。平末端DNA片段的连接：T4DNAligase 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴后，再用DNAligase连接。 a.同聚物加尾法

11、 b.衔接物连接法 c.接头连接法基因工程对载体的要求：在宿主细胞内能独立复制 有选择性标记 有一段多克隆位点，外源DNA插入其中不影响载体复制 分子量小，拷贝数多 容易从宿主细胞中分离纯化载体的分类：1，克隆载体克隆一个基因或DNA片段 2，表达载体用于一个基因的表达 3，整合载体 把1个基因插入到染色体组中质粒：独立于染色体外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。质粒的类型：1，接合型质粒，出了有自主复制必须的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 2，非接合型质粒，具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因。质粒DNA的复制类型：1，低拷贝型质粒，严紧

12、型质粒。 2，高拷贝型质粒，松弛型质粒。质粒DNA的分离与纯化:1,氯化铯密度梯度离心法。2，碱变性法 3，微量碱变性法表达型载体的元件：1，普通载体元件：复制起点ORI，选择标记，多克隆位点MCS2，大肠杆菌操纵子元件，阻遏基因I，操纵基因O，启动基因P，核糖体接合位点序列SD转录终止信号区。Plasmid载体必须具备的基本条件：1.具有复制起点ORI。2.具有抗菌素抗性基因，是筛选标志，理想载体应有2种抗菌素抗性基因。3.若干限制性内切酶的单一位点，用来插入外源DNA片段，且插入后不影响复制功能。4.具有较小分子量，较高拷贝数。PUC载体的优点：1，分子量小 2，选择方便 3，克隆便利具有

13、多克隆位点MCS 4，测序方便柯斯质粒载体：是一类由人工构建的含入NDA的序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。1. 大小：5-7kb。2.组成：入DNA：cos序列的控制包装序列。pBR322：质粒复制子，抗菌素基因，几个限制酶的单一位点。 柯斯克隆的特点：1.具有入噬菌体的特征：克隆外源DNA后可体外包装成phage颗粒在宿主cell内形成环化DNA，但不能形成新的phage颗粒而溶菌。2. 具有质粒载体的特征：大多带有pMB1或CoLE1的复制子，有抗菌素抗性基因和插入失活的克隆位点。3. 高容量的克隆能力：45kb（不能低于30kb）。4. 具有与同源序列的质粒进行重组的能力：在同一宿

14、主细胞中，可与同源序列的质粒形成于合体。克斯克隆的优点：1.是构建真核生物基因文库的一种特别有效的克隆载体。2.提高了筛选具外源DNA的重组质粒的几率。克斯克隆的缺点：1.载体片段自我连接。2.外源DNA自我连接。3.多个外源片段同时插入载体。稳定遗传的条件：1，每个世代至少复制一次 2，细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到俩细胞中噬菌体的基本功能：1.保护自己的核酸分子免遭环境化学物质的破坏 2.将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞3.将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而产生大量子代噬菌体。4.使感染的细菌细胞释放出自带噬菌体颗粒。克隆：在多细胞的高等生物个体水平上，具有相同基因型的同

15、一物种的2个个体或多个个体组成的群体。在细胞水平上，同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子水平上，凡带有一段DNA插入序列的，独特的宿主或载体单元就叫克隆。基因组文库：将某种生物的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。构建基因组文库的步骤： 1.染色体DNA大片段的制备 物理切割法，酶切法 2.与载体连接导入受体菌 粘性末端直接连接，人工接头法。cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保护和扩增称cDNA文库cDNA文库特点：不含内含子序列 可在细菌中直接表达 包含了所有编码pro.的基因 比DNA文库小得多，易构建cDNA文库的构建：（1）总RNA的提取。提取总RNA有商业化的试剂盒。（2）mRNA的分离纯化。A. 原理：利用真核生物mRNA都含有一段3polyA尾巴，将mRNA从总RNA(rRNA、tRNA等)中分离纯化。（mRNA只占总RNA的1%2%）B. mRNA的分离纯化。分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱，当纯度达到1.82.0时才可建库。（3） cDNA的合成。A. cDNA第一链合成。逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用Oli