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1、毕业论文文献综述食品科学与工程乌贼墨汁多糖的提取工艺研究摘要：本文对动物多糖的提取，分离纯化进行了简单的描述以及简单介绍了多糖分级纯化方法超滤法和柱层析法，同时对多糖的分析鉴定方面做了一定描述。关键词：多糖；提取；分离纯化；分析鉴定 多糖又称为多聚糖，是一大类天然产物，由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，是构成生命的四大基本物质之一，广泛存在于植物、微生物、动物1等有机体中。多糖类物质包括：糖原(glycogen)，甲壳素(chitin)，肝素(heparin)，硫酸软骨素(chondroitin sulfate)，透明质酸(hyaluronic acid)，硫酸角质素(keratan
2、sulfate)，酸性粘多糖(acid mucopolysaccharide)或糖胺聚糖(glycosam-inog lycan)。其中肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素都属糖胺聚糖2。由于多糖在临床上、食品工业、发酵工业及石油工业有着广泛的应用3，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点，到目前为止，已有300 多种多糖类化合物从天然产物中被分离出来4。本文对多糖的提取、分离和纯化、分析量和纯度等和方面的研究进展进行概括和综述。1 多糖的提取 根据多糖的存在形式及提取部位的不同，在提取之前确定是否需要进行预处理。动物多糖的提液，通常首先要去除表面
3、脂肪，一般将原料经粉碎后加入丙酮等脱脂，脱脂后过滤得到的残渣再用水作溶剂进行提取。如万淑莹等5将蚕蛹干粉经丙酮脱脂，沸水提取，乙醇沉淀分离制备多糖。多糖的提取目前常用碱解法、热水浸提法、酶解法或碱解与酶解相结合的方法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法。如刘兴杰等6碱提取法从绿疣海葵等4种海洋无脊椎动物中提取酸性粘多糖。陈菊嫡等7用碱解法提取分离花刺参酸性粘多糖；张红岩等8用木瓜酶消化方法提取分离鹿茸中酸性多糖C. Maes等9用碱性过氧化氢提取小麦麸皮中的非淀粉多糖。唐孝礼等10用碱解与酶解相结合的方法提取分离黑海参酸性粘多糖。邓永智11等利用微波辅助提取法从海水小球藻中提取多糖。钟丹等12采
4、用超声波提取牛蒡菊糖。Mysore13用热水浸提法提取高粱中的多糖。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤，也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上层清液合并(若为碱溶性多糖则需中和)。合并的多糖提取液经浓缩后，醇沉，也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，使与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮、乙醚等洗涤，将吸干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷或氢氧化钠的真空干燥器中或于真空干燥箱中减压干燥。若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时可直接冷冻干燥。2 多糖的分离纯化提取的粗多糖中常含有色素、多肽、蛋白质等杂质及无机盐类成分，因此需将其进行分离纯化。2.1 去除蛋
5、白几乎所有动物多糖都与蛋白质相连，因此动物多糖的提取首要问题是在多糖不被显著降解的条件下去除结合的蛋白质。多糖与蛋白质的结合不是物理或离子结合，而是共价结合。经碱提取及蛋白酶水解的组织消化液，是组分及性质相近的多糖混合物，它们的多羟基及强电解性使其处于可溶状态，除去残留蛋白质和各种小分子将为多糖的进一步分级分离创造条件。除蛋白常用的有Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法等电点沉淀法等。如佘志刚等14用Sevage法除蛋白制备鲍鱼多糖，吴梧桐等15用三氯乙酸法除蛋白制备猪胎盘脂多糖，吴红棉等16用等电点沉淀法除蛋白制备珠母贝糖胺聚糖。利用各种多糖的溶解度不同及电荷密度的差异进行分离，由于各
6、种多糖结构和活性的不均一性和分子量的高分散性，分离得到单一多糖后，还可按其理化性质及生物活性进一步分离17。2.2 脱色多糖中常含有一些色素，可以根据其不同性质采取不同的方法进行脱色。常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等)等。如柴向华等18在制备鲨鱼软骨多糖时用活性炭、白陶土进行脱色。另外，DEAE-纤维素是目前最常用的脱色剂，通过离子交换柱不仅可以达到脱色的目的，而且还可以分离多糖。2.3 分级纯化方法2.3.1 超滤法超滤现是一种种重要的分离纯化实验技术，广泛用于含有小分子溶质的各种生物大分子如蛋白质、多糖、酶、核酸等的浓缩、分离和纯化。溶质或悬浮物料按大
7、小不同而分离，比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留。在操作过程中不会改变产品的性能和活性，对不稳定产品是安全的，因而对于动物多糖这样的高分子生物活性物质来说是最适合的。Lignot等经比较证实超滤技术用于浓缩纯化硫酸软骨素的可行性，并证明孔径为0.1m 时超滤膜分离效果最佳。钮明洋19用超滤法代替透析法去除海洋真菌多糖提取液中的单糖等小分子杂质，结果表明超滤法所得产品的得率和多糖含量都高于透析法，更加适合于中试生产使用。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易勃附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要
8、克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。但总的来说，超滤技术的应用有很好的前景，将会引起更多的重视。2.3.2 柱层析法层析技术是常用的分离纯化方法。它是利用混合物中各组分的理化性质吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等的差异，在物质经过两相中，不断地进行交换、分配等过程，而这过程会产生不断的吸附一解吸一吸附一解吸作用，造成混合物中各组分距离不等的迁移，从而达到分离的目的。柱层析又称柱色谱，是通过色谱柱的分离作用，而达到纯化。动物多糖不能渗人到交联的结构中，因此不能在一般的树脂上被分离。而纤维素之所以具有分离、纯化高分子量化合物的能力，是因为它具有松散的亲水性网
9、状结构，有较大的表面积，大分子可以自由通过，因此对动物多糖来说，纤维素的交换能力比离子交换树脂要大，同时纤维素来源于生物材料，洗脱条件温和，回收率高20。范秀萍21用纤维素柱纯化珠母贝氨基多糖，得到高质量分数的氨基己糖。凝胶柱层析是另一类应用广泛的方法，它有交联葡聚糖凝胶系列柱、琼脂糖凝胶系列柱、系列柱等。凝胶起分子筛作用，分离的依据是分子的形状和分子的大小不同。钦传光22从泥鳅赫液中分离提取到中性的粗多糖，粗多糖经凝胶柱过滤，分离得到纯化的高聚糖和寡糖。3 多糖的分析鉴定3.1 纯度鉴定多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。多糖纯度鉴
10、定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HLPC法等。 现在应用较多的是HLPC法，旋光度测定23也是纯度测定的一种方法。3.2 分子量的测定多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作。常用方法：渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC法24、MALDITOFMS法。3.3 多糖结构分析多糖的结构分析手段很多，对多糖结构的分析是揭示其生物活性、构效关系的基础。多糖的一级结构含义比蛋白质丰富得多。要解决一种多糖的一级结构就必须解决多糖基的组成、糖基的排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头异构型以及
11、糖链有无分支、分支的位置与长短等。如成分复杂，也可折断成几种片段各自分析，然后凑成一个整个化合物。多糖的一级结构分析常用化学法和仪器分析法。如用核磁共振25分析羟基被取代情况。多糖序列分析即一级结构测定常用到红外光谱核磁共振、工具酶应用免疫学方法等2。目前研究多糖的二级结构常用的手段是NMR技术，如2DNMR，13C谱，通用的方法是将现代NMR技术与理论计算相结合通过一定的理论计算筛选构象，主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算26。圆二色谱法（CD）也可用于糖的构象分析，张丽萍等应用CD谱测定了金顶侧耳多锗的水溶液构象。近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动的规律
12、已达到前所未有的深度和广度，多糖作为一类重要的生物活性大分子其结构的研究势必推动对多糖的认识向深层次发展。3 前景随着分子生物学和分析新技术的高速发展，特别是许多技术的联用，分析手段变得更加快速、灵敏和高效，从而使得多糖的分离和结构测定方法也取得了快速的发展。近年来的工作取得了较大的进展，愈来愈多的多糖被发现。并证实它们具有复杂、广泛的生物活性和功能。随着对多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性机理，功效因子会更加明确，它的应用领域也将会更加拓宽。参考文献1 骆传环,黄荣清,刘曙晨.海星多糖的分子量测定J.军事医学科学院院刊,2002,26(2):5-7.2 殷涌光,韩玉珠,丁宏伟.动物多糖的
13、研究进展J.食品科学,2006,27(3):256-262.3 刘天龙,许剑琴.多糖现代研究及应用进展J.中国兽医杂志,2004,40(3):24-26.4 马宝瑕,陈新,邓军娥.中药多糖研究进展J.中国医院药学杂志,2003,23(6):360-362.5 万淑莹,何光星,徐嘉红.蚕蛹多糖的分离和分析J.中成药,1992,14(3):35.6 刘兴杰,刘传琳,任虹等.海葵等四种动物粘多糖碱提取的比较研究J.烟台大学学报,2001,14(4):264-268.7 陈菊嫡,樊绘曾,邢蕊凝等.花刺参酸性粘多糖的分离研究J.中国海洋药物,1994,(1):24.8 张红岩,吕琳.鹿茸酸性多糖的含量测
14、定研究J.中成药,1988,(10):34.9 C.Maes,J.A.Delcour.Alkaline Hydrogen Peroxide Extraction of Wheat Bran Non-starch Polysaccharides J.Journal of Cereal Science,2001,(34):29-35.10 唐孝礼,邱鹏新,黎明涛等.黑海参酸性粘多糖的分离纯化J.中药材,1999,22(5):223.11 邓永智,李文权,袁东星.海水小球藻中多糖的提取及其单糖组成的气相色谱质谱分析J.分析化学,2006,34(12):16971701.12 钟丹,张建新,张世恒.超
15、声波提取牛蒡菊糖J.西北农业学报,2008,17(2):29730013 Mysore. Water-extracted polysaccharides of selected cereals and infuence of temperature on the extractability of polysaccharides in sorghum J.Food Chemistry,1999,(64):345-350.14 佘志刚,胡谷平,吴耀文等.鲍鱼多糖Hal-A的甲醇解研究J.有机化学,2002,22(5):367.15 吴梧桐,高向东.猪胎盘脂多糖的分离纯化及其对脾淋巴细胞的诱导作用J.生物化学杂志,1990,6 (2):111.16 吴红棉,雷晓凌,洪鹏志等.珠母贝糖胺聚糖的纯化及其化学性质J.水产学报,2000,24(6):570.17 张彦民,李宝才,朱利平等.多糖化学及其生物活性研究进展J.昆明理工大学学报(理工版),2003, 28(3):140-149.18 柴向华,佘纲哲,吴克刚等.鲨鱼软骨多糖的提取工艺研究J.中国生化药物杂志,1999,20(1):38.19 钮明洋,姚文兵,姚金凤等.超滤法在海洋真菌多糖分离纯化工艺中的应用J.中国生化药物杂志,2004,25(3):61-6
