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1、毕业论文开题报告生物技术香鱼热休克蛋白HSP70基因ORF的克隆及生物信息学分析一、选题的背景与意义热休克蛋白（heat shock protein, HSPs），又称应激蛋白（stress protein, SP），是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于自然界原核、真核细胞中，正常情况下与应激条件下都发挥重要的生理功能。按HSPs分子量大小可将其分为以下几个家族：HSP100家族（100110KDa）、HSP90家族（分子量约8390KDa）、HSP70家族（分子量约6678KDa）、HSP60家族、小分子量smHSP(分子量约1530KDa)及泛素家族（78KDa）等，其中其中HSP70
2、家族是HSPs中最保守和最重要的一族，在大多数生物中含量最多，细胞受到应激后生成也最显著。HSP70具有分子伴侣作用、抗氧化作用、参与免疫作用和抗细胞凋亡作用等多种生物学功能，并且在免疫调节中也发挥着重要作用。香鱼（Plecoglossus altivelis）属鲑亚目、香鱼科、香鱼属，是我国重要的小型名贵经济鱼类，其肉质细嫩多油、营养丰富、清香无腥、色香味俱佳，素有“淡水鱼之王”之美称，曾被列入“雁荡五珍”，在我国大陆港台地区及日本东南亚更被称为“河鱼之王”，香鱼现已被国家列为二级保护动物。香鱼干品粗蛋白中含人体必需氨基酸68.85%，并有药膳价值。由于野生香鱼资源有限，故市场价格日益攀升，
3、国内鲜活香鱼收购价达150-300元/公斤，日本市场售价为1000-3000日元/公斤，加工成“色如黄金、可携千里”的香鱼干，每千克可达l000元以上。日本香鱼养殖年产量为8600吨，每年市场需求大约为3万-5万吨。我国发展香鱼养殖业自然条件比日本优越，浙江省沿海河流都适宜于香鱼的引种放流、放流增殖和沿河流水精养，因此，香鱼是一个具有重要经济价值的水产养殖品种。随着养殖面积逐年扩大，高密度的人工养殖导致病害频发，这些病害已成为制约香鱼养殖产业发展的瓶颈。近年来有研究将HSP70作为指示鱼类健康的生物指标。本研究以香鱼为材料，克隆HSP70基因的ORF并对其进行生物信息学分析，为进一步研究鱼类H
4、SP70的结构、功能和作用机制打下基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：1. 香鱼总RNA的提取本实验使用BIOZOL总RNA提取试剂盒（BioFlux，日本）提取紫色土豆总RNA。2. 逆转录合成cDNA使用AMV反转录酶（TaKaRa，日本）进行cDNA第一链的合成，将反应混和液在室温下放至10 min后，42 反转录1 h。3. PCR扩增HSP70基因ORF以香鱼反转录cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。4. PCR扩增产物的鉴定将含有目的片段的琼脂糖凝胶切下，使用小量胶回收试剂盒（Elutefast，中国）进行回收，之后使用pMD18-T Ve
5、ctor（TaKaRa，日本）进行连接反应。使用自制的大肠杆菌DH5感受态细胞进行转化。最后，在无菌条件下，对重组子进行筛选与鉴定。5. 测序6. 香鱼HSP70基因的生物信息学分析翻译、序列比对、蛋白质一级结构分析、二级结构分析、三级结构分析、进化树分析三级结构分析二级结构分析进化树分析蛋白质一级结构分析序列比对翻译 生物信息学分析测 序PCR扩增产物的鉴定 PCR扩增 逆转录合成cDNARNA提取 香鱼三、研究的方法与技术路线：四、研究的总体安排与进度：1.第一阶段（10月12月）：完成开题报告，查阅相关文献从而确定实验方法，制定实验步骤。2.第二阶段（2月3月）：HSP70基因ORF的克
6、隆及测序。3.第三阶段（3月4月）：生物信息学分析。4.第四阶段(5月)：完成毕业论文并答辩。五、主要参考文献：1 李明云, 丁夭喜, 竺俊全, 等. 我国香鱼的研究现状及增养殖前景J. 宁波大学学报: 理工版, 1999, 12 (4) : 85-90.2 谢起浪, 陈少波, 单乐州, 等. 我国香鱼的研究概况及发展方向J. 科学养鱼, 2002 (9) : 3-4. 3 沈骅, 张景飞, 王晓蓉, 等. Cu2 + 、Cu-EDTA对鲫鱼脑组织应激蛋白HSP70诱导的影响J. 环境科学, 2004, 25(3) : 94-97. 4 万文菊, 王纪亭, 石存斌, 等. 剑尾鱼热应激蛋白HS
7、P70 cDNA片段的克隆与序列分析J. 大连水产学院学报, 2007, 22 (1) : 1-5.5 吴龙涛, 宋林生, 胥炜. 栉孔扇贝热休克蛋白70基因cDNA的克隆与分析J. 高技术通讯, 2003, 13 (11) : 75 - 79. 6 张祖兴, 李明云, 陈炯, 等. 大黄鱼( Pseudosciaenacrocea) 热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备J. 海洋与湖沼, 2006, 37( 4) : 337 - 341.7 程培周, 刘晓, 张国范, 等. 荧光定量PCR 方法分析皱纹盘鲍HSP70在温度胁迫下的表达J. 海洋科学, 2007, 31( 10) : 7
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