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1、毕业论文文献综述生物技术卵黄抗体的研究进展摘要：卵黄抗体(IgY)是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，它是一种具有较强免疫功能的蛋白质，目前已被广泛应用于动物疾病的诊断及防治。本文对卵黄抗体的形成、性质、作用机理、分离提纯方法及其在检测诊断上和疾病防治方面的应用情况进行了综述，可以预见，随着研究的进一步深入，卵黄抗体的应用将不断扩大。关键词：卵黄抗体；应用；研究进展0 引言卵黄抗体(Egg Yolk Immunoglobauli 简称IgY)指母鸡所产蛋的蛋黄中含有的免疫球蛋白。卵黄抗体的研究始于19世纪末至20世纪初1，自1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来,人们对卵
2、黄抗体(IgY)的研究越来越多,认识也越来越深入,应用也日益广泛。目前它已被广泛地用于许多疾病,尤其是近几年来,在家禽传染病的防治上得到广泛应用。现阶段在卵黄抗体的形成、生物学特性等方面已研究的比较清楚，并且卵黄抗体作为诊断试剂和防治药物的研究愈来愈受到关注。本文就卵黄抗体的形成、生物学特性、作用机理、提纯方法以及应用等作一综述。1 卵黄抗体的形成禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后，产生一系列免疫应答反应，法氏囊内的B 细胞分化成为浆细胞，浆细胞分泌大量特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，
3、形成卵黄抗体2，3。 2 卵黄抗体的特性与哺乳动物相比, 产蛋母鸡生产抗体具有快速、成本低、效率高、产量高的特点。有证据表明, 卵黄原抗体对比哺乳动物原抗体有更好的生物学优势4。IgY在结构上类似于哺乳动物的IgG,但在化学结构上有许多不同点。IgY的分子量为180kDa,即67-70 kDa的重链和22-30kDa的轻链，沉降系数为7S，等电点接近5.25。而IgG 分子量为150kDa ,即50 kDa的重链和2223 kDa的轻链。IgY由于结构中比IgG重链多了一个恒定区,但却没有IgG特有的铰链区,所以IgY的摆动性、柔韧性下降, 但IgY的分子量较IgG大,所以稳定性较高。IgY具
4、有较强的耐热、耐酸能力,在pH49 的环境中稳定,在65 下可保持活性24h 以上。与哺乳类IgG相比, IgY有更多的疏水性分子,这恰好使它更适于脂类含量丰富的卵黄环境6。卵黄抗体IgY相对于传统哺乳动物的抗体IgG具有以下优点:（1）IgY不与哺乳动物补体、Fc受体结合，也不与葡萄球菌蛋白A（SPA）或链球菌蛋白G（SPG）结合；IgY 还不与血清中的类风湿因子（RF）结合，因而用IgY 检测可避免假阳性结果，提高免疫学检测的准确性2。（2）产生免疫反应所需的抗原剂量小，由于禽类与哺乳动物在种系发生史上距离较远,IgY抗体与抗原亲和力高,产生有效免疫应答所需的抗原剂量较小,且不易与哺乳动物
5、的免疫球蛋白发生交叉反应6。（3）每个蛋大约含100mg以上的IgY，一个月可达3g，相当于兔子的10-20倍；卵黄中没有其他的Ig，易于提纯5。（4）在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工，大规模生产是不切实际的，而利用蛋鸡生产抗体要方便的多1。3 卵黄抗体的作用机理特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽（Fab）部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌
6、黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区（Fe部分）留在肠内7。4 卵黄抗体的分离、提纯方法卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白质，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白（、）是水溶性的，而IgY是卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY4。4.1 卵黄抗体的粗提近二十几年来, 已建立了许多较为高效而经济的方法, 如聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提法、水稀释法、辛酸沉淀法(CA法)等。4.1.1 聚乙二醇（PEG）沉淀法PEG是非离子型水溶性聚合物,高浓度不引起蛋白质变性,沉淀时间比硫酸铵和
7、乙醇都短,不影响离心处理。该法最早由Polson 报道17。一般用PBS或TBS作缓冲液将卵黄液稀释5倍,加入3.5%的PEG 6000或硫酸葡聚糖,10 000r/min 低温离心25min后取上清,可得卵黄抗体粗提物。4.1.2 氯仿抽提法Ntakarutimana在15mL的蛋黄液中加入40mL TBS和40mL氯仿,以10 000 r/min低温超速离心25min后保留水层。中间层再用40mL TBS萃取一遍。两步得到的水层均为WSF。有些人还用丙酮作为萃取液。此法去除脂类比较彻底,上清液澄清透明,抗体回收率高,但上清液中残留有机溶剂,对抗体活性有影响,同时有机溶剂造成的环境污染比较严
8、重,因而此法仅适合实验室少量制备。4.1.3 水稀释法1:9倍的蒸馏水稀释卵黄,利用0.1 %的盐酸调节蒸馏水的pH至5.0 ,搅拌15min ,置4过夜后脂蛋白自然沉淀,通过以10 000 r/min 低温超速离心25min去除脂类,收集上清液即得WSF18。4.1.4 辛酸沉淀法(CA法)辛酸沉淀法(CA法)则是利用抗体蛋白的化学性质进行分离和纯化。在低离子强度、pH4.24.5的酸性条件下,辛酸可与绝大多数的卵黄蛋白反应,形成不可逆的沉淀,唯有IgY 类抗体蛋白不发生反应,仍留在上清中,离心除去沉淀,将上清的pH调整到7.0左右,用硫酸铵使IgY析出,可得到纯度80%以上的IgY,该法经
9、济、简便、快速, 不损害抗体活性, 回收率高8。4.2 IgY的精细纯化4.2.1 超滤法超滤法多使用多空纤维超滤膜进行, 也可在IgY的多次沉淀或亲和层析后用于研究的进一步纯化。Kim等研究表明19,用Amicon cell 系统,可截取大于一定分子量的蛋白,浓缩倍数可随意调整,对抗体活性无影响,是其中较好的方法。缺点是超滤装置成本较高。4.2.2 离子交换层析IgY多以葡聚糖交联的弱碱性阴离子交换剂DEAE为载体,磷酸盐缓冲液为吸附,洗脱体系进行分离纯化。陈天豹等用DEAE-TOY-OPEAL 650M 阴离子交换色谱法分离纯化IgY, 总蛋白回收率达93%20。4.2.3 无机物沉淀法该
10、法是蛋白质提取的经典方法,最常用的是硫酸铵或硫酸钠沉淀法。Ruan等用水稀释法粗提卵黄获得水溶性成分后,加入等体积磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)稀释,再加入饱和硫酸铵(pH 6.0-7.0)，使硫酸铵浓度为50% ,4静置1h ,5 000 r/min离心20min,弃上清。再用PBS 溶解沉淀至原IgY的体积,加入饱和硫酸铵至33%饱和度,5000 r/min离心20min,取沉淀。如此重复2-3次可获高纯度的IgY。4.2.4 凝胶层析Fu等在用水稀释法获得WSF后,再过SephadexG-75柱子,进行凝胶层析,可获得高纯度的IgY。Constantinoiu应用T-gel 纯化鸡的I
11、gY,回收率为63.7 %。5 卵黄抗体的应用卵黄抗体作为一种廉价、易获得的抗体，目前已得到越来越广泛的应用。5.1 卵黄抗体在动物疾病诊断、防治方面的应用在免疫诊断方面，由于IgY不激活补体、不结合类风湿因子、不与SPA、SPG、哺乳动物Fc受体，与IgG几乎无交叉反应，这使得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度，它可作为免疫学实验检测工具，用于测定循环复合物、类风湿因子和补体等，减少假阳性5。同时又避免了动物采血的痛苦，受到实验动物的保护者的欢迎。从而使得越来越多的的人倡议用卵黄抗体取代高免血清。在疾病预防方面，由于卵黄抗体能抵抗幼龄动物肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化，故常在幼
12、畜饲料或添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的卵黄抗体, 以使其获得有效的被动保护免疫力。何月英等利用小鹅瘟强毒制备的卵黄抗体, 对23 日龄雏鹅进行预防, 其保护率高达100%4。房祥军等报道在用不喂初乳的仔猪所做的试验中,不让母猪哺育初生仔猪而代之以代乳料,出生6 h内对照组与处理组分别给饲盐溶液或抗大肠杆菌的鸡IgY,结果表明,与对照组相比,饲喂鸡IgY的仔猪死亡率与腹泻率下降, 72 h后对照组和试验组的死亡率与腹泻率分别为65% 和85%、11% 和39%9。李沁光等报道,仔猪出生后口服猪大肠杆菌高免卵黄液,可明显降低仔猪黄痢的发生率10。此外，卵黄抗体还被广泛应用于许多动物疾病的治
13、疗，且效果都较为显著。如詹丽娥等用IBD、ND 和EDS- 76 三联高免卵黄抗体治疗上述三种疾病, 总有效率可达50%以上12。汪铭书应用抗鸭病毒性肝炎(DHV)的卵黄抗体治疗人工感染的鸭时, 当用1万倍LD50 强毒时保护率可达到100%13。张毓金等曾对流行于粤闽一带蕃鸭养殖区的花肝病研制出了抗蕃鸭花肝病的卵黄抗体进行治疗试验,结果表明该抗体对于花肝病的早期预防与治疗效果明显14。张英等用抗小鹅瘟的卵黄抗体治疗发病鹅群, 治愈率为95.2%。目前国内广泛应用于禽类疾病防治方面的有抗传染性法氏囊病、抗鸡新城疫、抗鸭病毒性肝炎、抗鸡减蛋综合症等卵黄抗体。用卵黄抗体治疗疾病, 安全、高效且无公
14、害, 我国已有商品化的卵黄抗体供应,如农业部已批准四川畜牧兽医学院研制的IBD 精制蛋黄抗体为二类新生物制品。5.2 卵黄抗体在水产养殖方面的应用卵黄抗体除了对以上陆生动物疾病诊断、预防、治疗方面的应用外，对于水生生物，特别是水产养殖方面也具有重要的作用。在水产动物，Gutierrez等(1993)报道日本鳗鱼通过口服特异性IgY,可降低死亡率,清除肠道病原菌,从而减少对肝和肾的侵害5。在水产养殖方面，白斑综合症是当前全球对虾养殖业所面临的危害性最大、影响范围最广的病害之一,并成为目前制约养虾业发展的主要瓶颈之一。目前,在畜禽生产中已经成功运用口服抗特定病原微生物的卵黄抗体来防治动物肠道微生物
15、的感染。但未见用抗WSSV(白斑综合症病毒)的卵黄抗体来防治对虾白斑综合症。闫东春21等曾报道，轮虫细胞膜可与白斑综合症病毒特异性结合，为探讨WSSV的治疗方法提供的一定依据。雷勇等以螯虾为动物模型,制备了可大规模生产的抗WSSV卵黄抗体制剂,并在螯虾上作应用效果试验, 证实饲料中0.2%的IgY含量具有良好的保护作用,为WSS的预防与治疗提供了一种全新的思路,并为WSSV卵黄抗体的开发应用提供关键的实验数据和理论依据，预计该种口服卵黄抗体在螯虾养殖中将会发挥越来越重要的作用11。此外，作为主要水产养殖品种的中华鳖也面临着一些疾病的困扰。其中以嗜水气单胞菌引起的中华鳖出血性败血症尤为严重。Sz
16、ilvia L.等22针对支原体16S rRNA基因的特异PCR进行探针检测，基于16S rRNA基因的部分序列的分析可知，华丽闭壳龟内的支原体似乎与最近描述东部箱龟中的支原体相同。李肖梁等利用含有抗嗜水气单胞菌鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的添加剂饲喂中华鳖,观察其对中华鳖生长和免疫功能的影响15。通过攻毒试验表明,特异性IgY抗体的饲料添加剂对该病具有较好的预防作用,与对照组和饲喂非特异性IgY 抗体组相比,死亡率可降低80.8%和79.2% ,肾脏中细菌总数也明显减少。这种通过被动免疫的途径为该菌引起的动物疾病预防和控制提供了科学依据。据报道,嗜水气单胞菌亦可引起软体动物、鱼类、两栖类、鸟类及哺乳类等多种动
