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1、毕业论文文献综述生物工程三疣梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析摘要：三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国海产经济蟹类，近年来浙江省沿海的三疣梭子蟹养殖业发展非常迅速，但是病害发生频繁，成为其稳产、高产的主要限制瓶颈。由于养殖水体中微生物的多样性特别是异养细菌的菌群结构及其演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义。关键词：三疣梭子蟹；海水养殖塘；微生物群落；弧菌1 三疣梭子蟹简介1.1养殖情况 三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus），俗称梭子蟹、白蟹，属于甲壳纲、十足目、9梭之间，最适子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。梭子
2、蟹一般在3-5米深海底生活及繁殖，冬天移居到10-30米的深海，喜在泥沙底部穴居。其适应盐度为16-35，水温在4-34，PH值在7-9盐度为26-32之间，最适温度在22-28。水质要求清新、高溶氧，当环境不适应或脱壳不遂时有自切步足现象，步足切断后能再生1。1.2 营养价值三疣梭子蟹产量高，体大肉多，味鲜美，营养丰富，尤其是卵巢和肝脏。卵巢可供作上等调味品。肉除鲜食外,还可制作罐头,畅销国内外。壳可作药材用，又可提取甲壳质，广泛用于多种工业。1.3 养殖存在的问题病害的发生是梭子蟹、病源菌和环境相互作用的结果，其中环境中的理化因子变化可改变养殖水体及底泥中微生物的群落结构，当管理不当，水质
3、恶化，再遇上天气的急剧变化（急剧降温、暴风雨侵袭、连续阴雨天等）时，有益有害微生物之间的平衡被打破，条件致病菌大量繁殖，导致梭子蟹疾病的发生，因此研究养殖水体中微生物的多样性特别是异养细菌的群落结构及其演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义2-5。1.4 养殖塘水质调节养殖管理正常的养殖管理同养虾基本相似，但还要根据蟹的不同习性，采取相应的不同管理措施。添换水前期添水，至水位升高后换水，根据水质情况调节换水量，高温季节高潮时尽量换水，日换水量。进入月交尾期后，要保持最高水位，并增加换水6。养殖塘菌种菌落对养殖塘水质则起到了自然调节的作用，对于减少三疣梭子蟹养殖过程中疾病发
4、病率等方面起主要作用7-12.2 分子生物学方法在微生物生态上的应用受技术的限制，目前自然界中的绝大部分微生物人们还无法对其进行纯培养（见表1.1）。1982年，人们提出了“不可培养（活）微生物”（viable but nonculturable microorganisms，VBNC Microorgani-sms）的概念（徐怀恕等，1982），即指利用迄今所采用的分离培养方法还未获得纯培养的微生物。由于不可培养微生物不论其类群，还是其新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着新颖性和多样性，因而比以往的可培养微生物具有更为丰富多样的可供人们开发利用的生物资源。表1.1 几个环境样品中可培养
5、细菌的比率Tab.1.1 Percentage of cultivated bacteria in some environmental samples环境样品可培养率（）海水（Sea water）0.010.10淡水（Freshwater）0.25湖水（Mesotrophic lake）0.11.0无污染的河口水样（Unpolluted estuarine waters）0.13.0活性污泥（Activated sludge）115沉淀物（Sediment）0.25土壤（Soil）0.3注：可培养的细菌是以菌落生成单位（CFU）来计算的（引自Amann et al，1995）目前应用最多的是
6、以PCR技术为基础的研究方法，这些研究方法的最初步骤都是通过PCR反应扩增目标序列，可操作性强，并且可以根据不同的分类水平（菌株、种、属等）使用不同的引物。2.1 变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE） 1993年Muyzer首次证实变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。近年来，该方法已被广泛地应用于各种环境微生态的研究中，主要是对微生物多样性进行定性或半定量的评估。DGGE的原理是：大小相同但碱基序列不同的DNA片段在含有变性剂的凝胶中电泳时，由于其解链时需要不同
7、的变性剂浓度，所以会在各自相应的变性剂浓度下变性，从而滞留于凝胶的不同位置。通过DGGE图谱，可以判断环境微生物群落中优势类群或独特种群的遗传多样性。某些情况下，为了得到更详细的信息，可以通过DGGE指纹与特定的寡核苷酸探针杂交或对切下的DGGE条带序列分析来进一步鉴定菌落成员13-14。2.2 16S rDNA文库构建 目前，构建16S rDNA克隆文库是微生物分子生态学中用来调查环境中原核微生物组成的常用方法之一。其过程是：提取环境样品中的DNA； PCR扩增16S rDNA序列并建立基因文库；扩增每个克隆中16S rDNA片段后进行测序；最后将所测得的序列与现有数据库中（Genebank
8、或EMBL）的已知序列进行比对分析，从而总结分析出关于微生物群落多样性的信息。文库中的序列信息不但可以用来分析样品中物种的丰度与多样性，还可以作为其他分子研究方法的基础，例如，用于设计荧光原位杂交（FISH）的探针或变性梯度凝胶电泳（DGGE）所使用的引物。Giovannoni（1990）等人最早使用该法研究了藻海（Sargasso Sea）中浮游细菌的多样性15。此后，很多学者都采用该方法对微生物多样性进行了类似研究（Fuhrman et al，1993）。克隆文库法虽然可以获得较多的微生物群落多样性的信息，但其对分析的克隆数目有要求，只有在克隆数目足够的情况下才可以较为完整的认识种群组成的
9、情况。为了使结果更具有代表性，通常利用物种丰富度的覆盖率评估来估算不同样品所要选取的克隆数目。此外，排除核酸提取、PCR及克隆过程产生的偏差，该方法的问题还在于如何能准确的评估出群落的多样性。为此，许多专家（Colwell et al，2004；Singleton et al，2001）提出使用参数或非参数的方法对种群的多样性进行评估16。在多样性丰富的生态系统中，针对该方法工作量较大、测序费用较高的问题，测序前通常要进行序列筛选以剔除重复序列而仅将代表序列进行测序。序列筛选一般采用前面所述的DNA指纹技术（如DGGE、SSCP、RFLP等）。以PCR技术为基础的其他研究方法还有：温度梯度凝胶
10、电泳法（Tempera-ture Gradient Gel Electrophoresis，TGGE）、核糖体基因间隔序列分析（Ribos-omal Intergenic Spacer Analysis，RISA）、随机扩增多态性DNA分析（Rando-m Amplified Polymorphic，RAPD）等17-19。3研究现状3.1国内外研究现状近年来，国内外已有很多养殖环境微生物群落结构研究方面的相关报道。从研究方法来看，已由传统的培养方法逐渐向各种分子手段转变，研究对象也集中在几类致病菌或某些功能微生物上。李秋芬等（2002）报道了虾池生态系统中几类细菌的季节性变化，他们发现在养殖
11、中后期弧菌和硝酸盐还原菌数量增长很快且数量较高23；高尚德等（1994）、郭平等（1994）的研究均发现养虾池中细菌的数量和变化规律同温度、pH值及虾病有密切关系20-22；王晓颖等（2006）研究了虾池沉积环境中若干功能菌及弧菌的时空变化。近几年，以PCR-DGGE为代表的DNA指纹图谱技术以及荧光原位杂交等分子手段常用于微生物群落的分析。Matthew等应用PCR-DGGE技术以及构建16S rDNA克隆文库的方法研究了南美白对虾育苗池微生物群落的多样性，结果发现不同分析方法所得出的结果之间存在着差异（Matthew等，2006）。从研究内容来看，微生物群落所处的环境也变得多种多样，包括网
12、箱养殖区、养殖池塘、滩涂等，所处的微环境（生境）也各不相同，包括养殖水体、沉积物，乃至养殖动物体内。国内外许多学者对海洋细菌的生态分布、对虾养成期间水体和虾体中的异养细菌进行了大量的研究但对梭子蟹养殖环境及生物体内的细菌学研究至今很少报道。国外的主要有K Muroga, K Sszuik, K Ishimaru对三疣梭子蟹弧菌larviculture，国内主要是张恒庆等对于三疣梭子蟹水体细菌多样性的研究和张德民等对三疣梭子蟹养殖塘底泥进行DGGE分析细菌多样性23-25。3. 2本实验室研究基础本实验室对宁海县明港东坝三疣梭子蟹养殖塘水体中的可培养细菌进行了为期3个月（7、8、9月份）的跟踪调
13、查，每个月采一次样，共分离纯化198株异养细菌，根据其菌落形态特征分为15个类群；DGGE带型和16S rDNA基因序列分析表明，198株异养细菌分属于4个门，5个纲，16个科，26个属，56个种，81个发育型，主要属于-变形杆菌纲(Gammaproteobacteria，130株，63.1%)和芽孢杆菌纲(Bacilli，47株，22.8%)。通过比较7、8、9月份的异养细菌群落组成发现水体中的异养细菌群落类群演替规律如下：（1）81个发育型中没有一个种或发育型同时出现在3个月份；（2）同个种或发育型在2个月份中同时出现的有7个科8个属，其余9个科18个属仅在一个月份中出现。综上所述，微生物
14、群落结构的组成及变化与海水养殖的关系十分密切，在养殖池塘的物质循环、能量流动、元素转化、生态平衡及环境净化等方面起着十分重要的作用。了解养殖环境中细菌群落的组成、功能及其多样性，有助于了解养殖池塘生态系的特性，并对病害起到早期的预警作用。4 展望尽管国内外许多学者对海洋细菌的生态分布、对虾养成期间水体和虾体中的异养细菌进行了大量的研究但对梭子蟹养殖环境及生物体内的细菌学研究至今很少报道。因此对于三疣梭子蟹养殖塘水体中的免培养细菌多样性还需要系统研究，从而为三疣梭子蟹的生态养殖提供保障。参考文献1 薛俊增，中国三疣梭子蟹Portunus trituberculatus Miers的研究J.东海海
15、洋，1977,15（4）. 2 陈梅，李筠，徐怀恕梭子蟹及牡蛎中致病性弧菌的研究J广西预防医学，2002，8(4)：1931963 阎斌伦 ,梁利国 , 张晓君. 三疣梭子蟹主要病害研究进展J. 水产科技情报 2010，37(1).4 王国花 ，钱彩源 ，李伟方微生物制剂在水产养殖中的应用J中国水产，2006，21(7)：83-845 林克文，三疣梭子蟹养殖及病害防治J.科学养鱼，2002,3：24-25.6 王浦东，三疣梭子蟹养殖技术J.海洋科学，1996,2：015.7 薛超波 ，王世意，童国忠梭子蟹养殖环境及生物体内细菌的数量动态及区系组成J中国水产，2005，24(12)：18-208 姜华，李爽 ，张德民，等对虾池中紫色非硫细菌 的分离及初步鉴定J辽宁师范大学学报：自然科学版，2007，30(2)：220-2229 黄毅 ，陶平，陈仕明，等深圳大鹏湾南澳养殖区主要环境因子分布规律的研究口J辽宁师范大学学报：自然科学版，2005，28(1)：103-10610 张恒庆,初航, 温丹，张德民. 三疣梭子蟹
