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1、基因工程及其在医药学中的应用,重组DNA技术,DNA Recombination Technique,基因工程相关概念 基因工程相关的酶学 基因工程的载体 目的基因的制备和分离方法 载体与目的基因的连接 重组体的鉴定与分析 隆基因的表达,本章主要内容,重组DNA技术的发展史,年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂
2、 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。,（一）DNA克隆,2.克隆化(cloning),(1)分子克隆(molecular clone),即DNA 克隆 ; (2)细胞克隆； (3)个体克隆（动物或植物）。,技术水平:,细胞的分化潜能,全能性(totipotency),一个细胞在一定条件下具有发育成完整个体的潜能，称为细胞的全能性(totipotency)。具有这种潜能的细胞称为全能性细胞。,细胞核全能性,3. DNA克隆 应用酶学的方法，
3、在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。,DNA克隆目的: 分离获得某一感兴趣的基因或DNA; 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。,重组DNA技术操作的主要步骤,目 录,（二）工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,1.限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE),(
4、1) 定义 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统：限制外源DNA，保护自身DNA，稳定细菌遗传性状。,(2) 分类、作用 、 （基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,(3)命名,EcoR,Escherichia coli RY13株 大肠杆菌 RY13株的第一种酶,(4)类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端
5、切口,粘端切口,同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,2. DNA聚合酶,3.TaqDNA聚合酶 (TagDNA polymerase),是一种耐热的依赖于DNA的D NA聚合酶，具有聚合酶活性，该酶最适反应温度为75 80 ,4.逆转录酶,5. Klenow片段,6. DNA连接酶 (DNA ligase),功能:催化DNA中相邻的5磷
6、 酸基和3羟基末端之间形成 磷酸二酯键，使DNA切口封 合或使两个DNA分子或片段 连接.,7. 多聚核苷酸激酶,8.末端转移酶,（三）目的基因,cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA),9.碱性磷酸酶,（三）基因载体 (cloning vector),1.概念： 携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,来源分类：质粒载体 噬菌体载体 病毒载体 人工染色体载体,用途分类：克隆载体 表达载体 穿梭载体,2. 常用载体:,克隆载体(cloning vector) 能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样
7、的载体为克隆载体。 表达载体(expression vector) 使插入的外源DNA序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。,这类载体中含有来源不同的复制子结构，即具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,所以能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达,穿梭载体（shuttle vector),3.载体具备以下条件:,1.具有自我复制能力,具有多个单一限制性酶切位点,具有选择性遗传标记,分子量小，拷贝数高,具有较高的遗传稳定性,松弛型的复制子、多克隆位点、 筛选标记.
8、 常见:质粒、噬菌体,克隆载体必需结构:,具有复制子，筛选标记，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子，起始密码子和核糖体结合位点，转录终止子结构,表达载体结构特点：, 概念: 存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子。,质粒 (plasmid),分子量相对较小，能在细菌内稳定存在 能在宿主细胞内独立自主复制 具有某些遗传标志, 会赋予宿主细胞一些 遗传性状； 具有多个限制酶的单一位点（多克隆位点）,质粒特点:,细菌质粒,质粒的复制类型,严谨型（strigent plasmid)： 复制与宿主染色体同步受宿主染色体复 制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约 份拷贝,松弛型（rel
9、axed plasmid): 复制不受宿主染色体复制的 限制可独立复制，在宿主细胞中拷 贝数高基因工程常用载体,常用质粒载体种类： pBR322 pUC,pBR322:人工构建重要质粒,优点：具有较小的分子量 具有两种抗生素抗性基因，可作 为筛选标记 具有高拷贝数 是松弛型质粒,目 录,pUC质粒特点：,来源于pBR322质粒的复制起 始点,具有两种抗生素抗性基因，但基因 内无核酸内切酶位点,含有大肠杆菌半乳糖苷酶-肽 段编码基因统称LacZ基因,靠近LacZ基因端有一段多克隆位点， 影响LacZ基因功能,含有一个调节 LacZ基因表达 的阻遏蛋白基因LacI,pUC质粒优点： 具有更小的分子
10、，更高的拷数 适于组织化学检测重组体 ,噬菌体(phage),噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,噬菌体(phage)载体系统分类：,M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,左臂,右臂,非必需序列,插入单一酶切位点或 一对内切酶位点,噬菌体DNA改造系统,粘性质粒(cosmid),结合质粒克隆载体和噬菌体克隆载体的优点,结构：质粒DNA接上噬菌体 粘性末端(cos).,粘性质粒(cosmid)：,具有噬菌体 粘性末端特性 具有质粒耐药性标记 具有多个限制性酶切位点 具有高容量的克隆能力 接上真核细
11、胞复制子和启动子及选择标记， 就能在真核细胞中存在和表达,粘性质粒的特点,酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其它,（四）目的基因,cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA),（一）目的基因的获取,1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3.
12、 cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)（见第22章）,化学合成获取目的基因,* 化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,分 子 文 库,基因组DNA文库获取目的基因 (genomic DNA library),组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,* 从基因组DNA文库获取目的基因,目 录,目 录,cDNA文库获取目的基因 (cDNA librar
13、y),目 录,引物,cDNA 文 库,基于核酸杂交的筛选; 基于抗原抗体反应的筛选。,在文库中筛选目的基因原理,聚合酶链反应获取 (polymerase chain reaction, PCR),5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR基本工作原理,目 录,目 录,PCR的基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR体系基本组成成分,（五）目的基因与载体的连接,经限制酶作用于目的基因与载体DNA，在连接酶催化下，来源不同双链DNA片段，断端重新形成，磷酸二酯键的过程
14、,连接原理,粘性末端连接 平端连接 一端粘性末端与另一端平端连接,连接方式：,方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接,粘性末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制酶切位点连接,目 录,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目 录,定向克隆,适用于：限制性内切酶切割产生的平端或粘端补齐或切平形成的平端,T4 DNA连接酶催化平端连接,平端连接,目 录,在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加
15、上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,同聚物加尾连接,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,目 录,由平端加上新的含有限制性酶切位点的接头，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头(linker)连接,人工接头及其应用,目 录,（六）重组DNA导入受体菌,受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 受体菌处于感受态(competent),感受态(competent) : 指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗 传物质经体内重组成为染色体中的一部分,导 致受体细胞某些遗传性状的改变.经人工处理 能吸收重组DNA分子敏感状态的宿主细胞， 称之为人工感受态细胞,导入
16、方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection),转化 (transformation)： 以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.,转染 (transfection): 以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程.,感染 (infection): 以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建 重组DNA分子,经体外包装成具有感染性 噬菌体或病毒颗粒后,借助于噬菌体或病 毒的蛋白外壳将重组DNA分子注入细菌 或真菌细胞,从而使目的基因得以复制的 过程.,（七）重组体的筛选,(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹,1. 直接选择法,2
