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1、基因工程、细胞工程 一、基因工程 1基本工具： (1)工具酶。 限制性核酸内切酶 (又称限制酶 )：切割目的基因和载体(断开磷 酸二酯键 )。 DNA 连接酶：缝合 DNA 片段断口处外侧链 (形成磷酸二酯键 )。 (2)载体应具备的条件。 能在宿主细胞内稳定存在并复制：便于目的基因的表达。 有一至多个限制酶切割位点：便于外源DNA 分子的插入。 具有标记基因：鉴定与选择重组DNA 分子。 2基本操作程序： (1)目的基因的获取。 基因文库获取， PCR 技术扩增，化学方法直接人工合成。 (2)基因表达载体的构建。 启动子：启动转录。 目的基因：控制需要的特定性状。 终止子：终止转录。 标记基
2、因：筛选重组细胞。 (3)将目的基因导入受体细胞。 导入植物细胞：最常用方法是农杆菌转化法，另外还有花粉管 通道法和基因枪法。 导入动物细胞：最常用方法是显微注射法。 导入微生物细胞：常用Ca2 处理使受体细胞处于感受态。 (4)目的基因的检测与鉴定。 分子水平检测：以目的基因单链作探针，进行分子杂交；抗原 抗体杂交。 个体水平鉴定：抗虫、抗病的接种实验。 3应用： (1)植物基因工程。 抗虫、抗病、抗逆转基因植物； 利用转基因改良植物的品质。 (2)动物基因工程。 提高动物生长速度；改善畜产品的品质；用转基因动物生 产药物；用转基因动物作器官移植的供体。 (3)基因工程药物。 (4)基因治疗
3、。 体外基因治疗；体内基因治疗。 二、植物组织培养与动物细胞培养的比较 三、植物体细胞杂交、动物细胞融合与细胞核移植 1若该图为植物体细胞杂交示意图： (1)原生质体的制备。 用纤维素酶和果胶酶除去植物细胞的细胞壁，得到原生质体A 和 B。 (2)促融方法。 过程中，常用的化学试剂是聚乙二醇。 (3)新细胞壁的形成。 过程形成的 D 细胞具有一定的形状，该过程与细胞中的高尔基 体密切相关。 (4)杂种植株的培育。 过程为植物组织培养，依据的原理是细胞的全能性，所得杂种 植株可育 (“可育”或“不可育” )。 2若该图为动物细胞融合示意图： (1)促融方法。 与植物体细胞杂交相比，过程中特有的方
4、法是灭活病毒处理。 (2)原理：过程的完成依赖于细胞膜的流动性。 (3)应用。 若 A 细胞为骨髓瘤细胞， B 细胞为 B 淋巴细胞，那么 D 细胞称为 杂交瘤细胞，由D 细胞连续分裂产生大量细胞的过程，称为克隆。 这种细胞既能无限繁殖，又能产生专一抗体。 3若该图为体细胞核移植过程示意图，假设C 细胞的细胞核来 自于 A 细胞： (1)受体细胞 (B 细胞)的选择理由。 第一：营养物质丰富，能满足早期胚胎发育的需要。 第二：体积较大，易于操作。 第三：含有使已分化的细胞核恢复分裂能力的物质。 (2)克隆动物的性状。 通过该过程克隆的动物主要性状由A 细胞决定。 1在诱导离体菊花茎段形成幼苗的
5、过程中，不可能同时进行 ATP 的合成与分解。 () 【答案】分析： 在诱导离体的组织或器官形成幼苗的过程 中，伴随细胞的增殖与分化等需要能量的生理过程，一定会进行 ATP 的合成与分解。 2重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA 分子脱氧核糖和 磷酸交替连接。 () 【答案】分析：DNA 分子杂交是通过碱基互补配对原则形 成的。 3将目的基因 B 直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞。 () 【答案】分析： 目的基因必须经构建形成基因表达载体， 才能导入受体细胞，否则不能正常表达。 4培养草莓脱毒苗所采用的主要技术是组织培养。() 【答案】分析： 植物的茎尖一般没有病毒感染，因此可以
6、通过组织培养技术培养茎尖细胞以获得脱毒苗。 5应用 DNA 探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基 因的存在及其完全表达。() 【答案】分析： 应用 DNA 探针技术，可以检测转基因抗 冻番茄植株中目的基因的存在及其是否转录，但不能检测其是否表 达。 6体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体。() 【答案】分析： 克隆动物通过核移植技术获得，不能通过 体细胞杂交技术获得。 7动物的生长激素基因转入植物体后不能表达。() 【答案】分析： 不同生物的基因具有相同的化学成分和空 间结构，合成蛋白质时共用一套密码子，因此动物基因可以在植物体 内表达。 8单克隆抗体技术可以用于治疗老年痴呆症
7、。() 【答案】分析：单克隆抗体特异性强，可以定向清除抗原， 达到治疗疾病的目的。 基因工程的基本工具 【典例 1】(2012新课标全国卷 )根据基因工程的有关知识，回 答下列问题： (1)限制性内切酶切割DNA 分子后产生的片段，其末端类型有 _和_。 (2)质粒运载体用 EcoR切割后产生的片段如下： AATTCG GCTTAA 为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用 EcoR切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的 特点是 _ _ _ _ 。 (3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA 连接酶有两类，即 _DNA 连接酶和 _DNA 连接酶。 (4)反转录作用
8、的模板是 _，产物是 _。若要在体外 获得大量反转录产物，常采用_技术。 (5)基因工程中除质粒外， _和_也可作为运载体。 (6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理 的大肠杆菌作为受体细胞，原因是 _ _ 。 【解析】(1)当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA 的 两条链分别切开时， 产生的是黏性末端， 而当限制酶在它识别序列的 中心轴线处切开时，产生的是平末端。 (2)为使运载体与目的基因相连，不同的限制酶应该切出相同的黏 性末端。 (3)DNA 连接酶根据其来源的不同分为两类， 一类是从大肠杆菌中 分离得到的，称为E coli DNA 连接酶；另一类是从T4噬菌
9、体中分离 出来的，称为 T4DNA 连接酶。 (4)反转录是指以 RNA 为模板在反转录酶的作用下合成DNA 的过 程， 可以在体外短时间内大量扩增DNA 的技术叫 PCR(多聚酶链式反 应)。 (5)基因工程中可以作为运载体的除质粒外，还有噬菌体的衍生 物、动植物病毒等。 (6)大肠杆菌细胞有细胞壁和细胞膜，能阻止质粒(外源 DNA) 等物 质的进入，只能通过Ca 2处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态 (感受态细胞 )，才能作为受体细胞。 【答案】(1)黏性末端平末端 (2)切割产生的 DNA 片段末端与 EcoR切割产生的相同 (3)E coliT4 (4)mRN
10、A(或 RNA)cDNA( 或 DNA)PCR (5) 噬菌体的衍生物动植物病毒 (6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源 DNA)的能力极弱 (1)基因工程常用的工具包括哪些？分别起什么作用？ (2)限制酶的特异性及其作用： 特异性： _ _ ； 作用部位： _ _ ； 末端分析： 同种限制酶切出的末端 _( 填“一定” 或“可能” )相同；不同种限制酶切出的末端_(填“一 定”或“可能” )相同。 【答案】(1)提示：限制酶 分子手术刀， DNA 连接酶分 子缝合针，运载体 分子运输车。 (2)提示：识别并切割特定的脱氧核苷酸序列 DNA 单链中两个相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键 一定可能 【
11、总结提升】 与核酸有关的酶的辨析 【变式训练】(2014南通模拟 )普通棉花中含 甘露糖苷酶基 因(GhMnaA2)，能在纤维细胞中特异性表达，产生的 甘露糖苷酶 催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研 人员构建了反义 GhMnaA2 基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉 花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下。请分析回答： (1) 和 过 程 中 所 用 的 限 制 酶 分 别 是 _、 _。 (2) 基 因 表 达 载 体 除 了 图 示 组 成 部 分 外 ， 至 少 还 有 _ 等(至少答两个 )。 (3)过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用Sma酶和
12、Not酶切正义基因表达载体获得0.05 kb、3.25 kb、5.95 kb、9.45 kb 四种长度的 DNA 片段，则用 Not酶切反义基因表达载体获得DNA 片段的长度应是 _和_ 。 (4)利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染 色 体 DNA的 区段 是 _， 转 化 后的 细 胞 再 通 过 _ 形成植物体。 (5)导入细胞内的反义GhMnaA2 转录的mRNA 能与细胞内的 GhMnaA2 转录的 mRNA 互补配对，从而抑制基因的表达， 其意义是 _ _ _ _ 。 【答案】(1)Hind、BamHSma (2)复制原点、终止子、标记基因等 (3)6.0 kb12
13、.7 kb (4)(含有 E6 启动子和 GhMnaA2 基因的)TDNA植物组织培养 (5)阻止 甘露糖苷酶合成，使棉纤维更长 基因工程的操作步骤 【典例 2】肺细胞中的 let-7 基因表达减弱， 癌基因 RAS 表达增 强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7 基因导入肺癌 细胞实现表达增强后， 发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技 术基本流程如图 1。 (1)进行过程时，需要用到_酶。 (2)研究发现， let-7 基因能影响癌基因RAS 的表达，其影响机理 如图 2。据图分析，可从细胞中提取_进行分子杂交，以直接 检测 let-7 基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，
14、可能是由细胞中 _(填“RAS mRNA”或“RAS 蛋白” )含量减少引起的。 (3)进行过程时，需用_酶处理贴附在培养皿壁上的细 胞 ， 以 利 于 细 胞 培 养 。 过 程 常 用 的 方 法 是 _ 。 【解析】(1)构建基因表达载体时，应用限制酶切开载体并插入 目的基因，再用 DNA 连接酶连接为基因表达载体。 (2)检测目的基因是否转录，可以从细胞中提取mRNA，与基因探 针进行分子杂交。 let-7 基因表达增强， 会使 RAS 蛋白翻译受阻， RAS 蛋白含量减少，使肺癌细胞增殖受到抑制。 (3)进行细胞培养时，需要用胰蛋白酶处理贴附在培养皿壁上的细 胞。转化动物细胞常用显微注射法。 【答案】(1)限制酶、 DNA 连接 (2)
