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1、1,临床病原学实验诊断,山东大学齐鲁医院检验科 孙恩华,2,感染性疾病: 指各种病原体(病原微生物、寄生虫)感染机体后所引起的传染性和非传染性疾病,3,临床病原学检查的目的,是确定感染的发生和性质，及早明确诊断，尽早选择适当的治疗方案，采取有效的预防措施，防止感染可能广泛传播所造成的危害,4,细菌、病毒、螺旋体、支原体、 衣原体、立克次体、放线菌、真菌、 寄生虫,导致感染性疾病的病原体,5,现代感染性疾病的流行病学特点,新传染病陆续被发现，如O 157 大肠杆菌出血性肠炎、疯牛病、埃博拉出血热、新型肝炎病毒 、SARS病毒、甲型H1N1流感病毒等 一些业已绝迹的老传染病又重新出现，如梅毒、霍乱
2、、结核等 细菌出现多重耐药性，导致抗感染治疗困难。 医院感染和条件致病菌感染增加，免疫功能低下人群增多,6,临床病原体检查的基本程序,医生、护士、病人、检验师：正确采集运送标本。 检验科：直接镜检、免疫学和分子生物学检测、病原体分离培养鉴定、药敏实验报告结果。 医生：明确诊断、合理用药。,7,第一节 标本采集、运送和检测方法,8,标本采集的基本原则,发现感染应及时采集微生物标本作病原学检查。 二、三级医院微生物标本送检率不应低于70%。 尽量在抗菌药物使用前采集标本。采集标本前应至少停药3天。如病人不能停药，应在下次抗生素使用前采集标本。 标本采集时，应严格执行无菌操作，减少或避免机体正常菌群
3、及其它杂菌的污染。,9,标本采集后应立即送至微生物实验室，放置时间过长会影响检验结果。如不能立即送检，一般应放在冷藏条件下保存送检。但某些菌株（如淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、嗜血杆菌、肺炎链球菌等）不仅要及时送检，而且在送检过程中要注意保温。 盛标本的容器必须经灭菌处理，但不得使用消毒剂和酸类处理（到细菌室领取），以免残留液体影响细菌的生长。送检时，标本切勿污染容器的瓶口和外壁，防止污染和传播。 送检标本应注明标本来源和检验目的，使实验室能正确选用相应的培养基和适宜的培养环境。,10,血液 标本的采集,1.采血时机及次数: 采血时机是明确诊断的第一重要因素。无论何时，采集血培养应该在使用抗生素之
4、前进行。,11,怀疑原发性菌血症、真菌菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或肺炎的患者：在寒战或发烧初期立即采集2或3份血培养。 不明病因的发热，如隐性脓肿，伤寒热和波浪热：发热开始采集2或3份血培养。24h至36h后，估计温度升高之前（通常在下午）立即采集2份以上血培养。 感染性心内膜炎，对急性心内膜炎患者1h（2h内）采集3份血培养，如果所有结果24h后阴性，再采集2份血培养。入院前两周内接受抗生素治疗的患者，连续三天采集血培养，每天2份。 * 一份血培养定义：同一穿刺所获得的血液接种到2瓶血培养瓶中（需氧瓶和厌氧瓶）,12,2.采血部位,多次采血时, 应在不同部位进行。 不要从血管插管内采血。
5、 3. 采血量 成年人采血量为10 20ml, 新生儿与婴幼儿为15ml。,13,脑脊液标本的采集,由临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中立即送检，不能暂时保存于冰箱中。 （因引起脑膜炎的病原体脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等抵抗力弱，不耐冷，易死亡）,14,胸腹水等穿刺液标本,无菌注射器穿刺抽取，置于抗凝与不抗凝无菌容器中立即送检（或直接注入血培养瓶）。 脓性标本应考虑同时做厌氧培养.,15,尿液标本的采集,应在用药前或停药3天后留取标本, 并使尿液在膀胱内停留68h以上,起床后第一次尿样阳性率较高. 无菌采集中段尿 如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本。 排尿困
6、难者考虑导尿采集标本。,16,呼吸道标本采集,类型：鼻咽拭、痰和经气管采集的标本。 上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑。,17,痰标本的采集,采集时间：晨痰，且在取痰前用清水反复漱口。 方法： （1）自然咳痰法： （2）气管镜下采集 （3）气管穿刺法。,18,创伤及脓肿标本的采集,无菌生理盐水擦洗表面后，无菌棉拭子采集病灶深部的脓液和分泌物，置运送培养基送检。 瘘管可用无菌手术取组织块或碎片放入无菌管内立即送检。 脓肿标本用碘酒、酒精消毒皮肤后，无菌注射器抽取脓液，也可切开排脓后用无菌棉拭子沾取，或将沾有脓汁的最内层敷料放入无菌容器内送检。封闭性脓肿怀疑厌氧菌感染，应隔绝空气
7、采集。 采样前病灶局部应避免使用抗菌药物或消毒剂。,19,粪便标本的采集,自然排便，挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。 排便困难者，采用直肠拭子采集。 怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养液送检。 传染性腹泻应连续送检3次。,20,生殖道标本,男性：无菌采集尿道口分泌物或前列腺液。 女性：用无菌棉拭子采集阴道或宫颈分泌物。怀疑厌氧菌感染，应采用阴道后穹隆穿刺法，并立即接种于厌氧平板。 疑似梅毒螺旋体感染，直接从外生殖器硬下疳蘸取渗出液，置于盖玻片上，立即送检。,21,厌氧菌培养,厌氧菌是人体许多部位（如皮肤、口咽部、肠道和泌尿生殖道）正常菌群中的一部
8、分，因此下列标本不能做厌氧培养：（1）咽、鼻、尿道或直肠拭子。（2）咳出的痰，通过支气管镜取的分泌物，排出或导出的尿、粪及胃内容物。,22,病原体检测方法：,直接显微镜检查 病原体分离培养和鉴定 病原体抗原检测 病原体抗体检测 病原体核酸检测,23,直接显微镜检查的目的与评价（1）,染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。 评价：为临床初步诊断提供依据。,24,革兰氏染色,革兰阴性双球菌：在生殖道标本或脑脊液中多为奈瑟菌属；在下呼吸道分泌物中提示为卡他莫拉菌,革兰阳性双球菌提示肺炎链球菌,25,抗酸染色,墨汁染色找新型隐球菌,26,直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，
9、是寄生虫感染的主要诊断依据。,27,直接显微镜检查的目的与评价（2）,不染色标本：用于观察病原体的大小、形态与运动等特性。 结果评价：部分病原体可借此初步诊断 1.暗视野显微镜下见弹簧状螺旋体，应怀疑梅毒螺旋体的感染； 2.直接镜检是诊断浅部真菌感染的主要手段。,28,29,病原体分离培养与鉴定的目的：,明确感染病原体。 为临床提供体外抗微生物药物敏感试验结果。,30,细菌分离培养与鉴定的结果评价,无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染的病原体。 存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合细菌的量考虑是否为致病菌。 如临床表现支持感染，但培养阴性，应考虑为标本不合格、培养不恰当等因素。 直接镜检找到
10、病原体，而培养阴性，应考虑有L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。,31,病毒分离培养与鉴定的结果评价,必须结合流行病学资料、临床表现、标本来源及病毒种类加以分析。 从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明确诊断。 从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人体不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒、流感病毒等。反之需相应的临床表现，才有病原学意义，如巨细胞病毒，肠道病毒等。 阴性不能排除病毒感染。,32,病原体抗原与抗体的检测,特异性 IgM可作为感染性疾病的早期诊断指标，且可区分原发与复发感染。 特异性 IgG，尤其双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体感染。 排除交叉抗原的影响，病原体抗原检测可明确
11、感染的病原体。,33,病原体核酸的检测,聚合酶链式反应(PCR)：扩增病原体微生物特异的DNA或 RNA片段。 探针杂交法：通过已知序列的探针与病原体的核苷酸杂交，用以了解病原体的有无。,34,病原体核酸检测结果评价,是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。 阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。,35,临床常见病原体检查方法：,细菌： 普通细菌：常采用直接镜检、分离培养与鉴定明确病原体。 难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物学检测，如军团菌感染以及幽门螺杆菌感染等。 流行病学调查：病原体抗体检测，如ASO试验与Widal反应等。,3
12、6,真菌：,直接显微镜检查：初步明确真菌感染。 分离培养：明确何种真菌感染。 真菌抗原检测：GM试验、 G试验,37,病毒、支原体、衣原体、螺旋体等病原体多进行病原体抗原、特异性抗体或核酸的检测方法。,38,第二节 临床耐药细菌的检测,39,抗微生物药物敏感试验(antimicrobial susceptibility test, AST)：对敏感性不能预测的临床分离株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物。,40,41,Automated AST Systems 自动化药敏系统,Vitek 2,MicroScan,Sensititre,Phoenix,42,体外抗菌药物敏感性试验的目的,临床分
13、离菌株，如不能对抗生素敏感性进行预测，必须常规进行药敏试验。 临床治疗效果差而考虑调整抗菌药物时。为经验用药提供可靠依据。 了解细菌耐药的流行病学情况，为医院感染控制部门提供防治依据。 评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等。,43,体外抗菌药物敏感试验的方法,体外抗菌药物敏感试验主要包括抑菌试验、 杀菌试验、联合药敏试验和检测细菌产生的抗生 素灭活酶等。常用方法有: 纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 杀菌试验 体外联合药物敏感试验,44,45,46,47,48,CLSI AST Standards 2010,MIC最低
14、抑菌浓度,纸片扩散法,The Tables表格,49,CLSI表1用于检测/报告的药物,50,CLSI表2A肠杆菌科菌的解释标准,51,药敏试验结果的解释（1）,敏感 S（susceptible）：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。 耐药 R（resistant）：表示测试菌不能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。,52,药敏试验结果的解释（2）,中介I (intermediate) : 该范围作为敏感与耐药之间的缓冲区.避免由于微小技术误差影响实验结果。 最低抑菌浓度（MIC）：能够抑制检测菌肉眼未见生长的最低药物浓度称为测
15、定药物对检测菌的最低抑菌浓度。,53,细菌培养的重要性,细菌获得性耐药机制的迅速发展，使细菌耐药问题变得十分复杂。某些细菌，在同一体内同时存在多种耐药机制，导致细菌多重耐药，治疗失败，给感染性疾病的控制带来巨大的障碍。临床医生单凭经验治疗的状况发生巨大变化，医生需要从实验室得到必要的信息来推测判断感染部位的病原菌及用药规律，使经验用药有依据。,54,抗菌药物临床应用指导原则 要求抗菌药物应用以病原学监测为基础。根据细菌药物敏感试验选择抗菌药物。危重患者等先给予抗菌经验治疗，获得敏感试验结果后调整给药方案。,55,革兰阳性菌主要耐药类型：,耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）和万古霉素敏感性降低的MRS
16、A（VISA）和VRSA 耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP） 肠球菌的耐药问题(VRE),56,革兰阴性菌主要耐药类型：,ESBLs（+）的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及奇异变形杆菌 持续高产染色体型-内酰胺酶(AmpC酶)的阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、吲哚阳性变形杆菌、铜绿假单胞菌等 多重耐药的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌等 产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌,57,（一）MRS（耐甲氧西林葡萄球菌）(methecillin resistance staphylococcus),MRS的特点是它们都具有一外来基因mecA，负责编码PBP2a，当PBP2a占优势时，由于-内酰胺类药对其亲和力低，使得MRS对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯、单环内酰胺类、 -内酰胺/ -内酰胺酶抑制剂类抗生素均耐药。并提示对氨基糖甙类、大环内酯类、克林霉素和四环素等多种抗生素耐药。,58,MRS 的治疗 轻度感染 利福平、SMZ-TMP、环丙沙星 严重全身感染 万古霉素,5
