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1、医学分子细胞生物学,细胞周期及其调控 Cell Cycle ATM基因是AT唯一致病基因； 对AT纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导P53蛋白增加、p21wAFl和Gadd45转录和翻译水平增强的动态变化，表明ATM很可能是DNA损伤反应途径中p53的上游分子。,ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene） 最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。 ATM编码蛋白激酶，与损伤DNA结合，信号通路有两条: 激活Chk1（check
2、point kinase）, 使cdc25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。 激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。,(3) P16INK4a P16INK4a基因位于人类染色体9p21区，编码由148个氨基 酸组成的分子量为16kD蛋白质。 P16INK4a与周期蛋白 D1竞争性结合G1期激酶CDK4CDK6，抑制其对pRB 的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的PRB结 合，依赖于E2F-1转录的基因不能转录，P16INK4a间接抑 制包括DNA合成在内的多种生化
3、反应，使细胞周期正 常运行。,（4）pRB pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化进行。 在周期蛋白CDK复合物与蛋白磷酸酶1的协同作用下， pRB的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1 限制点的“开启和关闭”，从而保证细胞周期的有序运行 及细胞的正常增殖。,生长因子与相应受体结合,通过信号传递促进cyclin基因表达；cyclin与相应的CDK结合为激酶复合物对pRb进行磷酸化； 磷酸化的pRb释放其结合并抑制的蛋白,主要是转录因子E2F以 及具激酶活性的CAB-1蛋白等；游离的E2F进入核内,与多种具 特殊序列的基因启动子区结合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氢 叶酸还
4、原酶、TK及E2F-1基因等),促进这些基因的表达；这些 基因的产物促进细胞通过G1/S调控点.CKI通过抑制cyclin-CDK 激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍与E2F结合,E2F则不能进入 核内发挥转录作用,使细胞停滞于G1期.,G1/S调控点以pRb为中心构成一个复杂网络的共同模式,细胞周期长短测定,脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法 流式细胞仪测定法(Flow Cytometry) 缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分 裂间期和分裂期的准确时间。,细胞周期同步化1,人工选择同步化（ 药物诱导法） 条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用： 将与细胞周期调控有关的
5、条件依赖性突变株转移 到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。,人工选择同步化2有丝分裂选择法：用于单层贴壁生长细胞。优点：细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。缺点：是 分离的细胞数量少。密度梯度离心法： 根据不同时期细胞在体积和重量上存在差别进行分离。优点：方法 简单省时，效率高，成本低。缺点：对大多数种类的细胞并不适用。,药物诱导法（DNA合成阻断法） G1/S-TdR双阻断法：将细胞群阻断于G1/S交界处。优点：同步化效率高，适合所有体外培养细胞体系。缺点：是诱导过程可造成细胞非均衡生长。分裂中期阻断法 通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分
6、裂中期。优点：是操作简便，效率高。缺点：是这些药物的毒性相对 较大。,第三节 DNA受损阻止细胞 周期的分子学说,一、DNA损伤的后果:,信号传导异常,长期效应,老化,肿瘤,疾病,DNA 修复机制,短期效应,异常增生和代谢,生理功能紊乱,细胞死亡,细胞增殖减少,基因表达异常,基因组不稳定,哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制,二 、细胞衰老的理论 （一）基因转录或翻译差错、代谢废物积累； （二） ROS引发脂质、蛋白质和核酸分子氧化性损伤； （三）端 粒 钟 学 说（telomere clock theory) （四）衰老基因与抗衰老基因 1.衰老基因 人类：载脂蛋白E4基因、淀粉样蛋白基因 p
7、16, p53 p21 RB基因 2. 抗衰老基因 WRN bcl-2,CDK22，cyclinA、B 和 c-fos表达下降,不能是Rb磷酸化,E2F与Rb结合，从而不能发挥转录作用,细胞不能进入S期,细胞进入S期,生长因子,（二）细胞衰老的生化变化 DNA复制、转录、修复能力 端粒长度 DNA甲基化 DNA / chromosome 损伤 2. mRNA与核糖体结合能力 蛋白质合成能力 3.蛋白质分子损伤，功能 酶活性,第四节 细胞周期与疾病,一、癌与细胞周期 癌基因(oncogene) : 能促使细胞无限增殖、癌变的DNA序列。分若干基因家族（已发现近百种癌基因） 抑癌基因（suppre
8、ssion-oncogene)：存在于正常细胞中、能抑制细胞恶性增殖的基因。,1细胞周期驱动机制失控 Cyclins的过表达（Overexpression of cyclins） 肿瘤的发生与cyclin（D、E）过量表达有关。 Cyclin D1（Bcl-1）过表达原因（原癌基因） 乳腺癌、胃癌、食道癌存在Cyclin D1基因扩增过度。,基因突变: Cyclin D1 T286突变 Cyclin D1泛素化受阻 Cyclin D1,染色体倒位（Chromosome inversion） Cyclin D1基因倒位于甲状旁腺启动子控制，Cyclin D1蛋白合成 染色体易位（Chromoso
9、me translocation) 甲状旁腺腺癌 Bcl-1 t(11:14) (q13:q32)易位 Cyclin D1受Ig重链基因增强子影响 Cyclin D1表达, CDK 表达异常 主要见于CDK4、CDK6过表达。 CDK4+ cyclin D结合 CDK4/cyclin D CDKs表达 pRb pRb磷酸化 细胞增殖过度 E2F G1/S过渡加速,【Cyclin D过表达致肿瘤机制】 Cyclin D过表达 + 生长因子 CDKs瀑布效应 细胞增殖过度 易发生细胞癌变,可能, CDI表达不足和突变 肿瘤细胞中常出现CDI（肿瘤抑制基因）表达不足或突变。 p16 InK4基因失活
10、原因 突变或缺失、染色体易位、p16 InK4高度甲基化。,Mechanism p16 InK4基因表达 CDK4与cyclin D结合 细胞周期处在“易于”被启动状态 易发生细胞癌变,G1/S交界处失察 P53 进入S期 DNA损伤 修复成功 G1/S检查 停顿G1期 损伤DNA修复 修复失败 细胞凋亡 下调bcl-2表达、激活bax 基因 P53,表2 人类肿瘤p53基因突变热点和频率 肿瘤型 突变频率（%） 突变热点 肿瘤型 突变频率（%） 突变热点 肺癌 56 157，248，273 前列腺癌 30 不确定 结肠癌 50 175，245，248，273 肝细胞癌 45 249 食道癌 45 不确定 胶质癌 25 175、248 卵巢癌 44 273 乳腺癌 22 175、248、273 胰腺癌 44 273 子宫内膜癌 22 248 皮肤癌 44 248、278 甲状腺癌 13 248、273 胃癌 41 不确定 白血病 12 175、248 头颈鳞癌 37 248 宫颈癌 7 273 膀胱癌 34 280 软组织肉瘤 31 不确定,DNA病毒: SV40、HPV、腺病毒等 P53蛋白失活,GOOD BYE,
