碱裂解法提取DNA的方法

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1、碱裂解法提取质粒 DNA实验目的1、掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法和检测方法；2、了解制备原理及各种试剂的作用。实验原理碱裂解法是基于 DNA 的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒 DNA 变性，再将pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒 DNA，而染色体 DNA 不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。细菌质粒是一类双链、闭环的 DNA，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂

2、传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒 DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒 DNA 的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒 DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，碱变性抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在 pH 值高达 12.6 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以 pH4.8 的 NaAc/KAc 高盐缓冲液去调节其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA

3、又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。一、材料 含 pUC19 质粒的大肠杆菌，1.5ml 塑料离心管，离心管架，枪头及盒、卫生纸。二、设备 微量移液器(20 l ，200l，1000l)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。三、试剂准备 1、 LB 液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于 800ml 去离子水

4、中，用 NaOH 调 pH 至 7.5，加去离子水至总体积 1 升，高压下蒸气灭菌 20 分钟。2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml 水溶液，-20 保存备用。3. 溶液：50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0） 。1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖 4.730g，加 ddH2O 至500ml。在 121高压灭菌 15min ，贮存于 4。4. 溶液：0.2M NaOH，1% SDS。 2M NaOH 1ml，10%SDS 1m

5、l，加 ddH2O 至 10ml。使用前临时配置。5. 溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加 ddH 2O 至 500ml。4 保存备用。6. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml ，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml ，加 ddH 2O 至100ml。121 高压湿热灭菌 20min，4 保存备用。1M Tris Cl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800ml H 2O 中溶解 121g Tris 碱，用浓盐酸调 pH 值，混匀后加

6、水到 1L；0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）： 700ml H 2O 中溶解 186.1g Na 2EDTA-2H 2O，用10M NaOH 调 pH8.0(需约 50ml)， 补 H 2O 到 1L。7. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。8. 无水乙醇；9. 70%乙醇；10. RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris Cl(pH7.5)，5mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100加热 15 分钟，

7、使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于 -20。11 灭菌双蒸水 ddH 2O四、操作步骤 1. 挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于 20ml LB（含 Amp100ug/ml）液体培养基中，37、250rmp 振荡培养过夜（约 12-14hr） 。2. 取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中，12000rmp 离心 1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。3、菌体沉淀重悬浮于 100l 溶液中( 需剧烈振荡，使菌体分散混匀。 ),室温下放置 5-10 min。4、加入新配制的溶液

8、 200l，盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴 5 min，使细胞膜裂解（溶液为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清） 。5、加入 150l 预冷的溶液 ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置 5min。 12000rmp 离心 10min。溶液为中和溶液，此时质粒 DNA 复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时 K+使 SDS-蛋白复合物沉淀。6、上清液移入干净 eppendorf 管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000rmp 离心 10min。 （450l 的苯酚/氯仿/ 异戊醇。 ）7

9、、小心移出上清于一新微量离心管中，加入 2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心 12000rmp10min。8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入 1ml 70乙醇洗沉淀一次，12000rmp 离心 5 min。9、 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。10、将沉淀溶于 20l TE 缓冲液(pH8.0，含 20g /ml RnaseA，约 4l)中，37水浴 30min 以降解 RNA 分子，储于-20冰箱中。注意事项 1. 提取过程应尽量保持低温。2. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀完全。沉淀 DNA 也可用异丙醇(一般使用等体积 )，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。