人胰岛素的制备（2020年10月整理）.pptx

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1、人胰岛素的制备,1,一、 获得目的基因 从供体细胞中提取 mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成 胰岛素 mRNA 互补 DNA，再以 cDNA 第一链为模板，在反转录酶或 DNA 聚合酶 I 的 作用在，最终合成编码它的双链 DNA 序列。即得到了目的基因。 反转录-聚合酶链反应法 (一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的 mRNA 1, 细胞总 RNA 的提取 : 取胰岛 B 细胞，用 PBS 洗后，加入 TRIZOL 试将细胞破裂，后用 DEPC 处理， 多次离心后，取 RNA 白色沉淀，测 OD 值，电泳。 2 ，从总 RNA 中分离 mRNA： 取上述提取的总 RNA 若

2、干，加入 Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打 匀。 70水浴（裂解 RNA 的二级结构）， 20-30条件下，静置（让 Oligotex 与 mRNA 结合）。 将 Oligotex/mRNA 复合物的沉淀加到 EP 管 SPIN 柱上高速离心， 加 Buffer 将其他 RNA 洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化 mRNA。 （二）mRNA 转录合成 cDNA 第一链 cone 第一链的合成 加入上步获得的 mRNA 和适当引物于 EP 管中，加入 RNase-free water，混 匀后,70反应 10 分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上 5min;稍

3、微离心 一下,顺序加入缓冲液、 RNA 酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素 利于检验）， 混匀，稍微离心反应物之后,42放置 2 分钟。取出置于冰上。,2,3,电泳分析，同位素活性测定。 （三）PCR 法扩增，特异合成目的 cDNA 链 通过胰岛素的特异引物，用 PCR 法进行扩增，特异的合成胰岛素的 cDNA 链 。 PCR 法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环 25-35 次 最后延伸 前端引物： 5-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cg

4、t ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3 后端引物： 5-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3 二、 组建重组质粒 采用 pQE-30 质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。 .双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体 DNA 和外源 DNA 片段，使载体和外源目 的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏 性末端可退火连接成重组 DNA 分子，从而实现 DNA 的定向连接。 .重组过程 pQE-30 用 Hind 和 BamH酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片 段。

5、外源 DNA 片段同样也用 Hind 和 BamH酶切并回收纯化酶切片段。双酶切 后的载体外源 DNA 片段混合退火，因为 Hind 和 BamH的黏性末端不匹配，避 免了载体和外源 DNA 片段的自身连接，外源 DNA 片段只能定向地连接到载体的 Hind 和 BamH位点之间。当然也不可避免发生载体的 Hind 和 BamH的黏 性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子 占少数，是低效转化。 三、构建基因工程菌 (一) 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A 链和 B 链同时表达法 将人胰岛素的 A 链和 B 链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳 糖

6、苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经 CNBr 处理后，分离纯化 A-B 链 多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得 A 链和 B 链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组 DNA 的转化 1, CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞：,4,取 100 ml 菌体培养至 OD600 = 0.5，离心收集菌体，用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2 溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2 溶液悬浮 菌体 ，冰浴放置 12 - 24 小时，备用。 2，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取 100 ml 感

7、受态细胞，加入相当于 50 ng 载体的重组，DNA 连接液，混匀。 冰浴放置半小时 。在 42 保温 2 分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰 浴中放置 1 2 分钟 。加入 1 ml 新鲜培养基，于 37 培养 1 小时（扩增） 。 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。 经典的 CaCl2 转化方法： a 将培养液转入离心管中,冰上放置 10 分钟,然后于 4下 3000g 离心 10 分 钟。 b 弃去上清,用预冷的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 10ml 轻轻悬浮细胞,冰 上放置 15-30 分钟后,4下 3000g 离心 10 分钟。 c 弃去上清,加入 4ml 预冷含

8、 15%甘油的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液,轻轻 悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 d 感受态细胞分装成 200l 的小份, 贮存于-70。 e 从-70冰箱中取 200l 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰 上。 f 加入 pBS 质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng,体积不超过 10l),轻轻摇匀, 冰上放置 30 分钟后。 g42水浴中热击 90 秒或 37水浴 5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分 钟。 h 向管中加入 1ml LB 液体培养基(不含 Amp),混匀后 37振荡培养 1 小时, 使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的

9、抗生素抗性基因(Ampr )。 i 将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含Amp 的筛选平板上,正面向上放置半 小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养 16-24 小时。 (二)重组子的筛选和鉴定（载体遗传标记检测） 1.初筛选 随机挑取转化单菌落，在 LBAK 培养基(含 100p gml 氨苄青霉素和 50ug/ml 卡那霉素)中进行培养，用 O.5mmolLIPTG 诱导表达。 表达情况用 165SDSPAGE 进行分析。 2.重组菌的后续鉴定 直接电泳检测法,5,将初筛选获得的重组菌扩大培养后，提取其质粒 DNA，通过 PCR 对其进行扩增， 利用有插入片段的重组载体的分子量

10、比野生型载体分子量大，用电泳法检测质粒 是否为重组质粒。 目的蛋白表达检验 所得菌体经溶菌酶超声破碎细胞后得到的包涵体进行 SDSPAGE 分析，所需基 因工程菌表达的外源蛋(His)6Arg-Arg-人胰岛素原以包涵体形式存在，其分子 大小约为 13kb，经电泳与胰岛素原 marker 对比，如条带显示有所需目的蛋白， 则所得菌既可做工程菌使用，经扩大培养后，斜面保存以便后续使用。 3.工程菌的保藏 15%甘油保存菌种，菌液=20:80,充分混匀后,-70 度保藏。 四、 培养工程菌 优化发酵条件 采用比浊法测定不同时间培养基中菌量， 绘制基因工程菌的生长曲线，在摇瓶培 养的水平下，采用优化

11、的发酵培养基发酵基因工菌，培养 4 小时候即进入对数生 长期，而且对数生长期可延长至 17 小时。 1，正交优化实验： 采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优化，该七 个因素为：种子活化方式，摇床转速(通风量)，IPTG 诱导温度，接种量，IPTG 添加量，诱导时间，补料方式。分别用 A、B、C、D、E、F、G 表示以每升培养 基收获湿菌体的量及发酵液的 A600 为目标量，考察条件优化的效果，进行八次 实验，对实验结果进行分析，优化出最佳实验条件。 2，其他条件优化： 在优化发酵条件的基础上，进一步就各种金属元素对苗体生长发重 组蛋白诱导的影响作了分析。 3，放大培养（比

12、较不同发酵工艺产量）： 在优化摇瓶水平发酵试验的基础上，放大至 1 L 培养基中比较两种 发酵工艺。在不同转速，通气量，pH 条件下，比较选择产量最高的发酵工艺。 五、 产物分离纯化 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品 的纯度要求也要高于传统产品。 基因工程药物的分离纯化一般不应超过 4-5 个步骤，包括细胞破碎、固液分离、 浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。,6,发酵液进行细胞分离，分别得到胞内产物和胞外产物。 胞外产物直接进行透析浓缩然后进行再复性及酶转化，再对产物进行高度 纯化，最后制剂即可。 胞内产物用溶酶菌或超声波将细胞破碎，细胞破碎后用

13、高速离心法进行固 液分离。分离后用变性剂或者离子去污剂得到包含体，再用变性剂（尿素）使其 变形，接着用二次复性法将其复性。对复性后的产物进行透析浓缩，然后进行再 复性及酶转化，再对产物进行高度纯化，最后制剂即可。 重组蛋白分离纯化的特点 重组蛋白质分离纯化的特点为：(1)大多数重组蛋白质产品是生物活性物质， 在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液 pH 值、离子强度的变化均可使蛋白质变性 失活 a(2)重组蛋白质产品在物料中含量很低，凰物料组成非常复杂。例如，利 用基因工襁菌发酵生产蛋白藤，物料中含有大量缀成复杂的培养基、荣体生产代 谢物等，疆拣蛋鑫囊魏含量嚣豢不瑟蛋鑫凄慈爨鹃 1。舂些嚣拣鬣囊矮存

14、在予 缀懿武或在胞内形成包含体，为获敬蛋白质，还需避行细脆破碎，结鬈物料中含 有大量的细胞碎片和胞内产物。(3)含蛋白质产晶的物料不稳定，蛋白质产品易 受料液中蛋自水解酶降解。(4)很多熏组蛋白质产品作为医药、食品被人炎利用， 因而要求蛋国艨产器必绥是裹癀缝铯瓣，产蘸无萤、兹致热源等。与传统麓生物 大分子分离方式楣镄，蘩缀蛋臼的分离纯纯恣憝秘用其携理稻化学性质的差异， 即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、祭疏水性以及与其它分子的亲和性等 性质建立起来的。 二次复性法： 05g 包涵体溶解于一定量的缓冲液 B(50mmolLGlyNaOH，8 molL 尿 素，B_巯基乙醇，pH 95)中，使

15、之充分混悬，静置 1 小时以上。混悬液分步逐 滴加入到缓冲液 C(50mmolLGly-NaOH，半胱氨酸一胱氨酸，pH 95)中，4 静置复性过夜。上样于已用 50mmolLGlyNaOH(pH 95)平衡的 DEAE-Sepharose FF 柱，用 01molL 的氯化钠梯度洗脱，通过 SDS-PAGE 确定 RRhPI 位置，用 DEAE-Sepharose FF 做离子交换层析，收集含 RRhPI 的洗脱峰 2，层析图谱见（图 6）。电泳检测显示(图 11)峰 2 主要为 RRhPI，及少量高分子杂质，收集峰 2 做 再复性。峰 1 为 pH 高于 95 及一些疏水性蛋白质形成的穿透

16、峰，绝大部分 pH 低于 RRhPI 的蛋白质和核酸类杂质则牢固地结合在柱子上，在较高盐浓度及 2mol L NaCl 的条件下被洗脱下来，形成其他峰 3 和峰 4。胰岛素原（RRhPI）的再 复性及酶切转化： 1,复性 将初步复性及纯化后的 RRhPI 通过透析浓缩，先后转换到缓冲液 B 和 D(50mmolL G1y-NaOH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)一还原型谷胱甘(GSH)pH95) 中，使蛋白浓度为 01O6 mgml，4静置过夜。 2,酶切 复性后的 RRhPI 复性液调节 pH 后加入一定量的胰蛋白酶(trypsin) 和羧肽酶 B(carboxypeptidase B)在 37。C 进行协同酶切一段时间，然,后滴加 2 molL ZnCI：至 ZnCl：浓度为 01molL 终止反应并沉淀生成的 hI，用双蒸水洗涤沉淀得较纯 B9 重组人胰岛素约 79 mg/L 培养基。 重组胰岛素粗品的纯化： 胰岛素粗品用 02 molL NaAcHAc，pH40 溶解。溶解后的样品通过 Superdex 75 进行纯化(图 10)，得 1、2、3 峰