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1、鸡-防御素-1重组毕赤酵母的制备与表达,姓名:庄 杰 导师:张兴群,概述,-防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽,除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外,它还参与机体免疫反应,如今由于抗生素的滥用引发的问题而日益引起人们广泛关注。 动物防御素具有代替传统抗生素的潜力,主要表现在:抗菌谱广,免疫原性无或低,对人畜无毒副作用,无残留,无耐药性,热稳定性和溶解性良好,对较高离子强度或较大pH变化耐受性较好。因此,防御素越来越受到研究人员的关注。,防御素,防御素是一类碱性阳离子抗菌肽,相对分子质量为3500-4500左右,分子中含有6-8个保守的半胱氨酸残基,形成3-4对分子内二硫键,并通过半胱氨酸分子间二硫键使
2、肽环形成反向平行的 -片状结构。根据其分子内半胱氨酸的位置和连接方式及前体性质的差异可分为 -防御素、-防御素、-防御素、昆虫防御素和植物防御素。防御素具有广谱抗微生物作用,包括各种细菌、真菌和一些具膜病毒,为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障。,抗菌机理,防御素种类多种多样,抗菌谱也各不相同。不同的防御素的作用方式可能不同,同一种防御素与不同微生物作用时机理也可能不同。防御素的杀菌机理主要有以下几种: 1. 破坏细胞膜,形成离子通道 防御素可以通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结合,其疏水部分在疏水作用和分子张力作用下,能够改变细胞膜的流动性和厚度,从而使细胞膜上出现孔洞,导致细胞质外渗或
3、细胞外的物质进入到细胞内,严重时会引起细胞膜崩解,导致细胞死亡。,抗菌机理,2. 抑制胞外大分子的合成 防御素对肽聚糖、几丁质及一些生物大分子合成、交联的抑制也可能是其重要的杀菌机理之一。 3. 抑制胞内功能 防御素也能够破坏某些重要的胞内过程,从而促进细胞死亡。在某些实验中发现微生物能够在膜不完整的情况下存活更长的时间,这就预示着防御素可能有非膜破坏杀菌机制的存在。,抗病毒机理,防御素抑制和杀伤肿瘤细胞的机制与杀菌的机制不尽相同,它比杀菌机制更为复杂。一方面,它能通过其细胞毒性,主要是对细胞膜、核膜、线粒体、细胞核染色体和细胞骨架等的损伤来达到杀伤肿瘤细胞的效果;另一方面,防御素能通过调动机
4、体免疫机能,从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵。,防御素的应用现状,1 在医药行业的应用 细菌对传统抗生素的耐药性是当今全球性难题,防御素因其具有广谱的抗菌活性,独特的抗菌机理,并与典型的抗生素具有协同作用,能中和内毒素,调节机体免疫应答和炎症反应,调节组织创伤修复等特点引起了人们的广泛关注 2 在食品行业的应用 在食品方面,防御素主要用作防腐剂,防止食品腐败变质。,防御素的应用现状,3 在农业上的应用 防御素在农业中可用于农作物抗病育种。 4 在畜牧业上应用 防御素作为饲料添加剂对细菌具有很强的抑制作用,能够促经畜禽生长,提高饲料的利用率,动物在采食以后不会再体内残留。,酵母表达系统,酵母是目
5、前研究比较成熟的一种表达系统,研究表明,防御素在酿酒酵母中的表达水平较低,而选用毕赤酵母则可获得高效表达,其表达水平高达70 mg/L,且重组肽具有与天然肽相似的二级结构和生物活性。,酵母表达系统,作为外源蛋白表达系统,毕赤酵母有其独特的优势:遗传操作简单;对重组蛋白可以进行翻译后加工修饰,从而使表达出的蛋白具有生物活性;具有强有力的乙醇氧化酶(AOXI)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达;对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使它能高密度发酵生长,表达量高,对工业放大生产有利;毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少,有利于外源蛋白的分离和纯化。,防御素毕赤酵母的构建及筛选,利用 TRNzo
6、l 试剂盒从安徽三黄鸡肝脏中抽提总 RNA,并进行电泳检测;根据 Genbank 中登录的鸡 -防御素-1基因序列,设计一对特异性引物,利用设计的引物扩增 Gal-1 成熟肽基因片段;将此片段与 pMD-18-T 载体相连,构建重组克隆载体pMD-18-Gal-1,转化大肠杆菌 DH5 后进行鉴定、序列测定;后将测序正确的目的片段与载体 pPIC3.5K 连接,构建重组表达质粒 pPIC3.5K-Gal-1,单酶切后用电转化的方法将构建的重组表达载体整合入毕赤酵母 GS115 中,然后进行了高拷贝的筛选和表型的鉴定。,高拷贝筛选,一般情况下,整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多,蛋白表达量就越高
7、。pPIC3.5K 含有 neo 基因,赋予毕赤酵母 G418 抗性。而 G418 抗性水平主要依赖整合的 neo 基因的数目。单拷贝 pPIC3.5K 整合入毕赤酵母基因组后,赋予毕赤酵母约0.25 mg/mL的 G418 抗性水平。因此可以通过 G418 抗性水平初步推断该克隆所包含的拷贝数。,高拷贝筛选,实验中使用浓度分别为0,50,100,200,300 g /mL的 G418 来进行高拷贝的初步筛选,然后进一步通过实时定量 PCR 来验证,两者结果基本一致。但也有研究发现高拷贝与高表达并不一定对应。因此,基因拷贝数对表达量的影响还无法预测,高表达菌株的筛选只应以表达蛋白量的高低作为唯
8、一标准。因此还需要进行下一步的表达工作来证明高拷贝是否能提高重组 Gal-1 的表达量。,转化子表型的鉴定,外源蛋白在酵母基因组中的整合方式有两种:一种是在 His4 或5AOX1启动子区域,酵母染色体上的 AOX1 基因保持完整,这种整合产生的菌株表型为Mut+;另一种是双位点置换,含 5AOX1 启动子、外源基因和转录终止区的表达单元将染色体上的 AOX1 基因置换下来,导致 AOX1 基因的缺失,因而只能依靠弱转录的 AOX2 基因,所以利用甲醇速度慢,由此产生的菌株表型为Muts。,转化子表型的鉴定,基于此原理,我们对转化子进行了表型鉴定,方法是以5AOX1/ 3AOX1作为引物,酵母
9、基因组作为模板进行 PCR 扩增。如果是 Mut+ 整合,可见两条带,一条与目的基因相关,另一条为 AOX1 基因(大小约为2.2 kb),如果是Muts整合,只有与目的基因相关的一条带。,重组酵母菌表达,培养基: 需要BMGY/BMMY(缓冲复合甘油或缓冲复合甲醇培养基)BMG/BMM(缓冲最小甘油或缓冲最小甲醇培养基)MGY/MM(最小甘油或最小甲醇培养基)进行表达。 BMG,BMM,BMGY,BMMY用于分泌蛋白表达,特别是当PH对蛋白活性比较重要时。它们是缓冲培养基,这与MGY、 MM不同。这四种培养基用磷酸盐缓冲,PH值在一个较大的范围内,可用于蛋白优化表达。酵母浸出物及蛋白胨作为“
10、混合饲料”,使生长更好并可积累大量表达产物。,重组酵母菌表达,蛋白酶:有些蛋白特别易受在中性PH值时有很好活性的蛋白酶的影响。在这种情况下,建议用MGY,MM培养基,因为当毕赤酵母在无缓冲培养基如MM中表达时,PH降至3或更低,许多中性PH蛋白酶都将失活。毕赤酵母对低PH值有抗性,因此低PH值不会影响生长。 如果表达蛋白降解了,尝试在无缓冲培养基中进行表达。 如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解,可将基因转入SMD1168 中,该菌株表型是his4pep4,缺失了蛋白酶,转化与表达程序与GS115相同,也可用于大规模发酵。,重组酵母菌表达,换气:毕赤酵母高效表达的重要因素是在甲醇诱导时充分换气。
11、基本上在诱导时,培养基不要超过摇瓶体积的10-30%。建议使用隔板摇瓶,用2-3 层干酪包布或松散合适的盖子盖住摇瓶,不要用很紧的盖子。(换气在诱导前大量培养时并不那么重要) 温度及振荡:所有表达需在30度的摇床中进行。温度不能超过30度很重要,如果摇床温度不稳,设置在28度。使用落地式摇床,速度为225-250rpm,如果为台式摇床,速度调至250-300rpm。,重组酵母菌表达,开始前:先证实重组子及对照重组子(无插入,1拷贝插入)在GS115中的表达情况。进行表达时,选择合适的对照很重要,可以更好地解释你的表达结果。表达对照如下: GS115/ HIS+ Mut+ -gal Mut+胞内
12、表达对照 GS115/HIS+ Muts Ablumin Muts 分泌表达对照 GS115/载体(无插入) 背景对照 GS115/载体(1拷贝插入) 单拷贝基因表达水平对照 不同的重组形式均会影响表达,建议挑取6-10个克隆进行表达水平筛选。,重组酵母菌表达,Mut+胞内表达:为检测表达条件是否有效,可培养GS115-gal (Mut+)(胞内表达-半乳糖苷酶)。亲代载体转化GS115作为胞内表达背景对照。 1 挑取单克隆,接种至25mlMGY,BMG或BMGY中,(250ml摇瓶),28-30度,250-300rpm摇至OD600=2-6(对数生长,大约16-18小时) 2 室温1500-
13、3000g离心5min,收集细胞,去除上清,用MM,BMM或BMMY重悬细胞至OD600=1.0,进行诱导表达(大约100-200ml) 3 在1L摇瓶中加入上述培养物,加盖两层灭菌纱布或干酪包布,放入摇床继续生长。,重组酵母菌表达,4 每24小时,加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量,确保正确加入甲醇,因为蒸发作用会减少培养基的体积。 5 在下列的各个时间点,取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点:0,6,12,24(1天),36,48(2天),60,72(3天),84,96(4
14、天)。 6 用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE,western blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达(SDS-PAGEp47)。,重组酵母菌表达,Muts胞内表达:可培养GS115 Ablumin (Muts,分泌白蛋白至培养基中)检测培养条件的效率。记住要用转化亲本载体的GS115作为胞内表达的背景对照。 1 挑取单克隆,接种至含100mlMGY,BMG或BMGY的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30度,250-300rpm生长至OD600=2-6(约16-18小时) 2 室温1500-3000g离心5min 收集细胞,去除上清,用1/5-1/10原培养基体积的MM,BMM或BM
15、MY重悬细胞(约10-20ml) 3 置于100ml隔板摇瓶中,用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口,放入摇床继续培养。,重组酵母菌表达,4 每隔24小时,加入甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。 5 在下列的各个时间点,取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点:0,6,12,24(1天),36,48(2天),60,72(3天),84,96(4天)。 6 用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE,western blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。,重组酵母菌表达,SDS-PAGE分析: 任何
16、标准SDS-PAGE仪器及程序均可用,如12%聚丙烯酰胺凝胶,5%浓缩胶用于分离40-100kDa蛋白。 样品准备:需要准备Breaking 缓冲液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠 细胞洗涤准备:(胞内或分泌表达) 1 快速融化细胞沉淀,置于冰上 2 每1ml样品,加入100ul裂解缓冲液(细胞+上清) 3 加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm),通过置换来估算相等体积,重组酵母菌表达,4 涡旋30s,冰上孵育30s,重复8次 5 4度最大转速离心10min,将上清转移至干净的微量离心管中 6 取50ul上清(细胞裂解物),加入50ul2SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(样品buffer) 7 煮沸10min,每孔加10-20ul,依胶的厚薄及孔量,决定点样量。剩下样品存于-20度,用于western blot。细胞裂解物存于-80度用于分析。,重组酵母菌表达,如果没有表达或表达极低: 1 可以进行northern blot 分析或检查基因转录情况。 2 PCR分析插入情况。PCR选取12-20个转化子才可信,用空载体及单拷贝插入载