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1、,第十一章 色谱分析的基本原理,11.6 色谱的定性和定量分析,第十一章 色谱分析的基本原理,11.1 概述(Overview),11.2 色谱图的展开及相关术语,11.3 色谱分析理论基础,11.4 色谱理论,11.5 色谱分离条件的选择,色谱法分离的基本原理是基于组分通过互不相溶的两相而达到分离的，即样品溶解在流动相(Mobile Phase)中。从装填在柱子中或涂渍在载体表面的固定相(Stationary Phase)上通过，依据组分与固定相之间的相互作用力的不同。经过充分的运行时间，它们即可被分离。 色谱法是一种分离技术，这种分离技术应用于分析化学中，就是色谱分析。,一. 色谱法分离的
2、基本原理,11.1 概述(Overview),分离原理： 使混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，称为固定相，另一相是携带混合物流过此固定相的流体，称为流动相。当流动相中所含混合物经过此固定相时，就会与固定相发生作用。由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。流出的物质用相应的检测器进行检测。这种利用物质在两相间分配原理而使混合物中各组分分离，进而同时进行分析的技术称为色谱分析法，或色谱法（又称色层法，层析法）。,最早的色谱分析法是俄罗斯植物学家Michai
3、l- Tswett在1906年，将碳酸钙装填在玻璃管(也称为色谱柱，Column)内，石油醚洗脱，用于分离植物叶子中的叶绿素，植物叶子的提取液在通过柱子后，在柱床上出现了不同颜色的色带，因此他将这种方法命名为色谱法(Chromatography)。这就是最早使用的柱色谱法。,外色谱法即柱色谱法(Column Chromatography),即是说，在气相色谱、高效液相色谱或液体色谱中，所有的组分在相同的流动相推动下通过柱床，由于组分与固定相之间特殊的作用力，各个组分在柱后显示了不同的保留时间，并可用外部连接的检测器检测。,二 .色谱法的分类,一.色谱图的展开 在柱色谱分离方法中最常用的是洗脱技
4、术(Elution Technique)，在该法中，首先将样品溶解在流动相中，然后将其加入柱顶，最后用流动相洗脱，直到各个组分被分离，并在柱后检测。图11-1是样品A，B，C三组分的色谱分离洗脱示意图。,11.2 色谱图的展开及相关术语,图11-1 色谱洗脱原理图,流动相,当样品被加入柱上，样品就在两相之间进行分配，当流动相连续地加入柱顶，组分就在柱内新的流动相和固定相之间分配，与固定相的作用力强的组分比作用力弱的组分保留的时间长，经过一段时间的洗脱，它们即可被分离，并可在柱后以不同的时间顺序依次流出并分别被检测。 在柱色谱中，根据检测信号与洗脱时间或洗脱体积的函数关系得到的图称为色谱图(Ch
5、romatogram)。柱中物质的谱带移动存在着两种趋向。峰间距的增加，和峰的扩展造成峰变宽。,图11-1 色谱洗脱过程与色谱图,t，min,A,B,C,信号,原则上改进分离的条件为： 1、改变组分的移动速率； 2、峰的展宽降到最低限度,图11-1 色谱图中的相关参数,二. 色谱图的特征值,1. 基线 当色谱柱没有组分进入检测器时，在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的线称为基线。稳定的基线是一条直线。如图中的ot所示的线。 基线漂移：指基线随时间定向的缓慢变化。 基线噪声：指各种噪声所引起的基线起伏（波动）。,2. 保留值 保留值是用来表示试样中各组分在色谱柱中滞留时间 的数值。通
6、常用时间或用组分流出色谱柱所需流动相的体积来表示。,死时间tM 指不与固定相作用（吸附，溶解）的物质（如空气，甲烷）从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间。,死体积VM 指色谱柱在填充后柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相可以忽略不计时死体积可由死时间与色谱柱出口的载气体积流速F0(mLmin-1)来计算。 VM = tM F0,保留时间tR 指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间。 调整保留时间 tR 指被扣除死时间后的保留时间。,保留体积VR 指从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值时所通过的载气体积，即 VR =
7、 tR F0,调整保留体积VR 指被扣除死时间后的保留时间。即； VR = tR F0 VR = VR - VM,相对保留值r2,1或 指某组分2的调整保留值与另一组分1的调整保留值之比：,r21亦可以用来表示固定相（色谱柱）的选择性。 r21值越大，两组分的tR 相差也越大，分离也越好。 r21=1时，两组分不能被分离。r亦可用来表示。,图11-2 色谱流出曲线图,区域宽度 色谱峰区域宽度是色谱流出曲线中的一个重要参数。从色谱分离的角度看，希望区域宽度越窄越好。,利用流出的曲线（色谱图）可以解决以下问题： （1）根据色谱的位置（保留值）可以进行定性检定 （2）根据色谱的面积或峰高可以进行定量
8、测定 （3）根据色谱峰的位置及其宽度，可以对色谱柱分 离情况进行评价。,标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半,峰底宽度Y 自色谱峰侧的转折点所作切线在基线上的截距，如图2-3所示。它与标准差的关系为 Y=4,半峰宽度Y1/2 又称半宽度或区域宽度，即二分之一峰高处对应的峰 宽度，它与标准偏差的关系为, 11.3 色谱分析理论基础,一. 色谱分析的基本理论,在气相色谱分析的流程中，多组分的试样是通过色谱柱而得到离的，那么这是怎样实现的呢？,在填充柱内填充的固定相有两类 即气-固色谱分析中的固定相和气液色谱中的固定相。,在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比称为分配系数K。,一
9、定温度下，各物质在两相间的分配系数是不同的。分配过程是色谱分离的依据。,在实际工作中常应用另一表征色谱分配过程的参数分配比。分配比亦称容量因子或容量比，是指在一定温度、压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相间的质量比，用k来表示：,式中VM和VS分别为柱中流动相和固定相的体积为容量比。,（1）分配系数是组分在两相间分配达到平衡时的浓度之比，分配比则是组分在两相间的分配总量之比。,（4）分配比与保留时间的关系 若流动相在柱内的线速度为（cms-1), 由于固定相对组分有保留作用，所以组分在柱内的线速度us将小于流动相的线速度u，则两速度之比称为滞留因子Rs,（2）分配系数决定于组分和两相的性
10、质，与两相体积无关。分配比不仅决定于组分和两相的性质，且与两相体积比有关。,（3）对于一给定的色谱体系，组分的分离最终决定于组分在每相中的相对量，而不是相对浓度，因此分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数。,显然Rs亦可用质量分数来表示：,组分和流动相通过长度为L的色谱柱，所需时间分别为：,又以上各式可得：,流动相：,不同组分的的k值不同，tR不同，因而可使各组分得一分离。,组 分：,11.4 色谱理论,试样在色谱中的分离过程的基本理论包括两个方面：,1.试样中各组分在两相间的分配情况-热力学过程,2.试样中各组分在色谱柱中的运动情况-动力学过程,一. 塔板理论,为讨论方便，假设： 塔板数
11、为10, 进样量：1mg, k=1 即p=q。,塔板理论假定： （1）平衡迅速 （2）脉动式进载气，一次一个板体积（ V） （3）试样开始加在零号塔板上，纵向扩散可忽略不计 （4）分配系数在塔板上是常数,引用了处理蒸馏过程的概念、理论和方法来处理色谱分离过程：将连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复。,塔板号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9,图11-3 色谱保留图,此式成为流出曲线方程式。式中c0为进样浓度，tR 为保留时间， 为标准偏差， c为时间 t时的浓度。,由塔板理论可导出n与色谱峰峰底宽度的关系：,式中色谱柱的长度L，tR及Y1/2或Y用同一单位（时间或距离),考虑到死时
12、间不参与柱内的分配，提出了有效塔板数的概念：,1. 色谱峰越窄，塔板数n越多，理论塔板数H就越小，此时柱效能越高，因此n和H可一作为描述柱效能的一个指标。,2. n有效和H有效能较为真实地描述柱效能的好坏。,*同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的。,通常用塔板高度和塔板数来评估色谱柱的柱效。所以，塔板理论可以近似描述柱内过程的实际情况。,塔板理论在解释流出曲线的形状（呈正态分布），浓度极大点的位置及计算和评价柱效等方面都取得了很大的成功。,速率理论,但它在某些方面的基本假设是不成功的： 纵向扩散忽略 分配系数与浓度无关 迅速达到平衡,不能很好的解释,溶质在柱内移动过程中存在着有限的传质过程,
13、色谱峰在朝前运动的同时还存在纵向扩散，这种影响与溶质在两相中运行速度（传质过程）有关，1956年荷兰学者范弟姆特(Van Deemter )等人在研究气相色谱时，提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。该理论吸收了塔板理论中塔板高度的概念，并同时考虑色谱过程中影响塔板高度的动力学因素，指出填充柱的柱效受分子扩散，传质阻力和载气流速等因素的控制。 速率理论指出，谱峰变宽受到三个动力学因素的控制，即涡流扩散项，分子扩散项，传质阻力项。,二. 速率理论-范弟姆特方程式,常用几种不同的近似数学模型来解释，在工程领域中转换成色谱过程范氏方程(Van Deemter Equation),式中 是流动相的平均
14、线速 A，B，C为三个常数。其中A为涡流扩散项，B为分子扩散系 数，C为传质阻力系数。 H为塔板高度。 *u 一定时，只有当A，B，C较小时，H才能最小,柱效才会高。 *而当A，B，C为一定时，对于H的影响则呈双向性。,（一）涡流扩散项A,常数A称为涡流扩散(Eddy Diffusion)，当流动相碰到填充物颗粒时，不断的改变流动方向，使试样组分在流动相中形成类似“涡流”的流动，因而引起色谱峰的扩张。, A=2dP A与填充物的平均颗粒直径dP（单位为cm)的大小和填充的不均匀性有关。对于空心毛细管柱A等于0。,涡流扩散现象,（二）分子扩散项 试样组分被带入色谱柱后，是以塞子的形式存在与色谱柱
15、的很小一段空间中，在塞子的前后存在着浓差而形成浓度梯度，因此使运动着的分子，发生纵向扩散。B与路径弯曲因子及组分在流动相中的扩散系数D有关。对于气相色谱： B=2 Dg,B项受纵向扩散的影响，该项使峰中心向前后的扩散，与颗粒的大小无关，直接与溶质在流动相中的扩大散系数成正比，与溶质的摩尔质量成反比。在液相色谱中B项几乎与流动相的流速无关。在气相色谱中，B项是非常重要的。在纵向扩散的影响中，塔板高度与流速成反比，也就是说，随着流动相流速的提高，塔板高度H变小，柱效提高。,流动相的传质阻力CM和固定相的传质阻力CS。 如为气相色谱则为Cg和Cl之和。 在传质阻力项中，随着流动相流速的提高，塔板高度
16、H增大。流动相的线速度的影响与纵向扩散项相反，也就是说，由于溶质在两相中的传质需要一定的时间，常常流动体系并不能即可达到平衡，所以，当提高流速时，传质过程便显得更加重要了。,（三）传质阻力项Cu,在流动相中的传质阻力项CM它表示了流动相中溶质的传递能力。在一定的色谱条件下，它与涡流扩散是相关的，与溶质在流动相中的扩散系数成比例，直接依赖于填料的颗粒大小，且与柱直径大小有关. 固定相传质阻力项CS分为两种不同的情况，一种是涂渍在载体表面的固定液；另一种是固体固定相。 在气-液相分配中随着液膜厚度的提高而增大，随着在固定相中的扩散系数变小而变小。较厚的液膜和较小的扩散系数使溶质在到达界面的速度变小。传质变慢，传质阻力项变大。 如果固定相是由固体材料组成
