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1、第二讲 观察标本的处理,切片法： 即用刀片将观察标本切成薄片。 优点：观察标本组织间的各种构造，仍能保持正常的相互关系。 缺点：在一个切片上就不能看到整个组织外貌。,分散法： 即用化学的或物理的方法，将观察标本分离成单个细胞或薄片，或者将整个观察标本进行整体封藏。 优点仍能保持每个小单位的完整。 缺点彼此间相互的关系（除整体封藏外）就不一定看得清楚了。,第一节 整体及局部特征制片 第二节 扫描电镜观察标本简介,第一节 整体及局部特征制片,一、昆虫整体封片 二、昆虫软组织制片技术,一、昆虫整体封片,（一）昆虫胚卵整体封片 （二）昆虫局部器官的整封片,（一）昆虫胚卵整体封片,固定、解剖：将布安氏液
2、(苦味酸、冰醋酸和甲醛以一定比例配制）固定好的卵粒放入蜡盘，注入70%酒精，在实体镜下用尖嘴无齿摄及解剖针撕开卵壳，取出完整的卵胚，放入装有70%酒精的小瓶中。 染色：用吸管吸去70%酒精，加数滴硼砂洋红浸没标本，染色5-10分钟。 脱水、透明：用70%酒精洗涤2-3次，再经80%、90%、100%酒精逐级脱水30分钟。然后用二甲苯透明2小时。,（一）昆虫胚卵整体封片,封片：载玻片上滴上粘稠的树脂，把已透明好的胚胎放在树脂内，摆好位置。做好的整封片水平放置在30恒温箱中，3一4周后，待树脂充分凝固即可装盒。,（二）昆虫局部器官的整封片（气门）,固定：在实体镜下，取昆虫气门一对，投入70%酒精内
3、固定1小时。 染色：用吸管吸去固定液，滴入硼砂洋红染色5分钟，吸去染色液后，用70%酒精洗涤几次。 脱水、透明及封片：经80%、90%、95%酒精逐级脱水15分钟，用100%酒精脱水两次，每次10分钟，用100%酒精和二甲苯等量混合液处理30分钟，转入二甲苯液中透明30分钟至1小时即可用中性树胶封藏。,二、昆虫软组织制片技术,（一）涂抹制片 （二）压碎制片 （三）离散制片,（一）涂抹制片（血液涂片）,取血液：用左手持住经乙醚麻醉的虫体，右手持昆虫针刺破幼虫的腹足基部，迅速将伤口流出的血液滴在洗净的载玻片上。 涂片：左手持血液载玻片，右手持另一个载玻片，以其一端边缘置于血液的左侧。右手将玻片稍向
4、后拉，血液立即充满在两玻片的斜角中，再以30-40度斜角向左均匀推过去，即涂成血液薄膜玻片。 固定、染色及封片：涂片稍稍晾干，滴甲醇数滴以覆盖血膜，固定3分钟。用吸水纸吸去甲醇液，滴上数滴10%吉姆萨染液，染色10一30分钟或更长。染色后用磷酸缓冲液分色，至着色清晰为度，然后晾干涂片即可封藏。,（二）压碎制片 -双翅目幼虫唾液腺的染色体的制片,取出唾液腺：挑出三龄老熟幼虫放入生理盐水中。左手持尖嘴无齿镊，捏住幼虫尾部约1/3处，右手持解剖针用平稳的力量向右移动，将幼虫的头节拉开可见唾液腺。 解离：将唾液腺放入盐酸溶液中处理5一8分钟，使腺体细胞分离，然后用吸水纸吸去盐酸溶液。然后用蒸馏水滴洗2
5、-3次。 染色：用石炭酸品红染液，染色15-20分钟，即可在低倍显微镜下观察核内染色体被染成紫红色，细胞质为浅红色。,（二）压碎制片,4。染色体释放：将盖玻片压盖于腺体上，随即用解剖针轻轻按压盖玻片，染色体便成串地从破裂处分散到腺体周围。再以拇指对着盖玻片垂直地压一下，既吸去多余的染液，又使染色体的形态及位置固定下来。 镜检：取出载玻片与盖玻片分别在低倍镜下检查。 脱水、透明及封片：将载玻片和盖玻片分别经95%、100%和100%三个洒精皿中停留1-2分钟，然后再分别经两个二甲苯皿中透明5分钟，即可用中性树胶封藏。,（三）离散制片（肌肉制片）,解剖蜜蜂，取出肌肉用FAA固定液(甲醇5ml，冰醋
6、酸5ml和70%酒精90ml配合而成)固定24小时。然后经50%、30%酒精和蒸馏水各1-2小时，并多次用蒸馏水洗涤。 用马克凯郎氏液(硝酸10ml,甘油20ml和蒸馏水20ml配成)浸泡2天。经多次蒸馏水洗涤，将组织块置于载玻片上，盖上盖玻片，轻压并稍转动使组织块分散。 将分散后的极小组织块加入Orth锂卡红（碳酸锂饱和水溶液100ml和洋红3-5g,煮沸l5分钟,冷却后过滤配成）染色20分钟。然后吸去染液，70%酒精洗涤几次，再用蒸馏水洗涤数次。,（三）离散制片,将组织块放入蒸馏水中，用注射器抽吸冲击使之分散成单个细胞，取上部的悬浮液（内含单一肌纤维）迅速倒入另一瓶中。 悬浮液自然沉淀后，
7、吸去上清液，经15%、30%、50%、70%、80%、95%、100%各级酒精脱水5-6小时，然后放入冬青油和100%酒精的等量混合液中经24小时，再用纯冬青油透明。 用吸管吸出单个肌纤维滴入蒸发皿中，加入适量的中性树胶，搅拌均匀后，滴一滴在载玻片，盖上盖玻片封片即成。,第二节 扫描电镜观察标本简介,扫描电镜（SEM）是利用高能微束电子针（电子流）轰击样品表面，使之发出多种信号,再收集其中某种或某些信号加以处理放大而成像的。,观察标本制备的一般程序：,取样 清洗 固定 洗净 脱水(逐级进行) 干燥 喷镀（导电处理）。现以昆虫表面形态特征的观察标本制备为例说明其制备过程。,昆虫表面形态特征标本制备操作步骤：,取昆虫材料以0.01mol磷酸缓冲液洗净，如被覆有蜡质或粉末，则以二甲苯去除蜡或粉末以求尽量显示其表面形态特征； 固定，用10%的戊二醛予以固定1小时； 洗净，以0.1mol磷酸缓冲液漂洗2-3次； 再将样品放入1%锇酸固定液中固定2小时左右，再洗净，磷酸缓冲浓反复漂洗，洗净锇酸；,逐次丙酮脱水； 自然干燥或临界点干燥； 喷涂，在高真空中以大电流、低电压、加热喷涂金属，使之以原态高速蒸发出来而喷涂于样品表面，形成厚100-200A的金膜，借此导电。 喷涂后即可观察。,
