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1、组织DNA的提取与纯化,检验系生化教研室 陈宁,讲课内容,一、概述,DNA在生物组织中以核蛋白的形式存在于细胞核中。 单倍体人类DNA平均相对分子量为61010 道尔顿，相当于1.3105kb。,DNA的分类有：,真核DNA,细菌DNA,病毒DNA,质粒DNA,DNA样品的来源：,组织 肝脏、赘生物、肌肉、培养细胞 血液 细菌 培养细菌、质粒,二、实验原则,保证DNA一级结构的完整性 排出其他干扰性分子的污染,干扰分子,对酶有抑制作用的物质,样品中存在的其他生物大分子,有机溶剂、高浓度的金属离子等,蛋白质、多糖和脂类 应尽量将此类物质的浓度降低到最小程度,相应抽提对象之外的核酸污染,DNA抽提
2、时，应避免RNA干扰,相关因素对于核酸的影响：,机械剪切力、高温剧热环境,过酸、过碱的反应体系,各种核酸酶降解效应,物理因素,化学因素,生物因素,操作轻柔，切忌剧烈混匀、震荡；控制实验温度,pH 410,EDTA缓冲液,避免干扰因素的解决方法,简化操作步骤，缩短提取过程，减少各类因素对核酸的降解。,三、实验操作及相关试剂介绍,【实验方法】 物理方式：玻璃珠法 超声波法 研磨法 冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法 酚-氯仿抽提法 碱裂解法 生物方式：酶法,酚-氯仿抽提法,提取组织,组织匀浆,水相 (DNA,RNA),絮状沉淀 (DNA,少量蛋白质,RNA),DNA,裂解液,苯酚-氯仿,离心,离心,离
3、心,氯仿-异戊醇,5mol/L NaCl,冰无水乙醇,75%乙醇,TE,1. 裂解液,0.1mol/L NaCl,1% SDS （十二烷基磺酸钠）,10mmol/L Tris-HCl pH8.0,1mmol/L EDTA pH8.0,阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。,抑制DNA酶活性,pH值适宜DNA游离至水相，避免降解。,2. 苯酚-氯仿,（3:1，V:V） Tris-HCl 饱和,操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂。,苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。,3. 氯仿
4、-异戊醇（24:1，V:V）,经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。,加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,4. 5mol/L NaCl,使水溶液中的DNA易于聚合，从而形成钠盐沉淀。,反应体系为pH 8.0时，DNA分子所带的电荷为负电荷。加入NaCl溶液后，Na+能够中和DNA外周的负电荷，减少DNA分子之间因同种电荷产生的排斥力，使得DNA分子相互靠拢。,5. 冰无水乙醇,冰：,低温条件能降低分子运动，
5、避免DNA破坏，而易于沉淀出DNA。, DNA不溶于乙醇 。 乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。 乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。 所以，之前须加入5M NaCl。,6. 75%乙醇,洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，保护DNA完整性，避免降解；抑制核酸酶活性。,7. TE缓冲液,TE缓冲液是Tris + EDTA缓冲液，一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控pH。 TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性。 DNA在TE提供的环境中稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环
6、及断裂。包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液中保存。,【操作】,抽提组织加入裂解缓冲液制成匀浆,加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，2500rpm离心10min,吸取上清液至干净离心管 加入等体积氯仿-异戊醇，摇匀5min，2500rpm离心10min,记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀释至0.3mol/L,再加入2.5倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀,2500rpm离心10min，弃去上清液,加入1ml 75%乙醇混匀，2500rpm离心5min。弃去上清液后再重复一次,沉淀DNA去除多余乙醇后，在快干时（半透明状）加入2ml TE缓冲液,
7、检测DNA浓度、纯度,START,加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，2500rpm离心10min,苯酚-氯仿试剂具有挥发性，对人体有毒。故，使用完毕后及时盖上试剂瓶盖，保持实验室良好的通风。 如果发生试剂溅滴至皮肤、粘膜，务必及时用流动水冲洗。,记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀释至0.3mol/L,再加入2.5倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀,5mol/LVNaCl=0.3mol/L(V上清液+VNaCl),VNaCl= （3V上清液 ） / 47,检测DNA浓度、纯度,取完全溶解后的DNA原液进行1:100稀释， 即1l原液 + 99l
8、水，混匀。,紫外分光光度计检测： A260 = ? A280 = ?,DNA纯度鉴定,A260 / A280, 1.6 1.8 2.0,酚、蛋白质污染,视为纯度较高的DNA,RNA污染,DNA浓度鉴定,DNA (g/ml) =,A260 稀释倍数 50 1/光径,DNA在260nm处存在吸收峰,检测时对于原液的稀释程度,1OD相当于： 50 g/ml DNA 40 g/ml RNA 20 g/ml 寡核苷酸,四、注意事项,组织抽提前应保存于液氮中，以免DNA受到破坏；纯化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA等防止DNA降解。 剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。 要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。 DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有吸收峰。当纯度比值小于1.6时，应考虑进行再次纯化。 整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操作规范安全。,思考题,整个实验过程中，一共有几次离心？每次离心的作用是什么？各个分层中的内容是什么？,The End,请至507、509教室进行试验操作，谢谢！,
