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1、报告汇编Compilation of reports20XX报告文档借鉴学习实验1：抗ANA自身抗体的检测（欧蒙斑点法）一、实验目的及原理抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是一组针对细胞核成分的自身抗体。ANA阳性提示患有自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮病、原发性胆汁性肝硬化等。根据细胞内各分子的理化特性和分布部位，ANA可分为抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体和抗其他细胞成分抗体。在本实验中，抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）的检测模条上平行包被了高度纯化的自身抗原。用于体外定性
2、检测人血清或血浆中的抗nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然SS-A和Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1)CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和AMAM2共14种不同抗原IgG类抗体。欧蒙印迹法的实验原理如下：样本血清与包被抗原的检测膜条温育，如果标本为阳性血清，则血清中的自身抗体将与膜条相应位点上的自身抗原特异性结合。洗膜后添加碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗人IgG（二抗），将与结合在膜条相应抗原位点上的自身抗体（一抗）结合，形成抗原-1st Ab-2nd Ab复合物。最后，加入酶底物 NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-磷酸盐
3、）显色，阳性血清在对应膜条抗原条带处原位可形成蓝紫色的化合物沉淀。二、实验材料1. 包被抗原的检测膜条2. nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、PMScl、Jo-1、CENP B、PCNA 、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白3. 阳性对照：人IgG，100 倍浓缩，1x0.02ml4. 酶结合物：碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，10倍浓缩，1x3ml5. 样本缓冲液，直接使用，1x100ml6. 清洗缓冲液，10 倍浓缩，1x 50ml7. 底物液：NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲哚-磷酸盐），直接使用，130ml8. 温育盘2x8槽三、实验
4、步骤（一）预处理l 试剂盒平衡至室温30分钟后使用，取出膜条。l 清洗缓冲液， 10倍稀释：30mL 清洗缓冲液+270mL DW，50ml/支分装。l 血清样本，使用前101X稀释：No.1666血清 210uL +21mL 样本缓冲液10mL/支，分装2支；按排一组作阳性对照： 0.02ml 阳性对照+2ml 样本缓冲液。l AKP-羊抗人IgG，使用前10倍稀释：AKP-羊抗人IgG 2.1 mL + 18.9mL样本缓冲液10mL/支，分装2支。（二）正式处理1. 预处理5min用镊子取出膜条，数字面朝上放入温育槽中，每槽中加入1.5ml 样本缓冲液；常温 摇床震荡5min。2. 抗原
5、和血清（1st抗体）温育30min枪头吸去槽内液体，在温育槽中分别加入1.5ml 已稀释血清，常温，摇床震荡30min。3. 清洗15min用枪头吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1.5ml 清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5 min。4. 加10X稀释的酶结合物（二抗），抗原-抗体-羊抗人IgG（二抗）温育30min吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5 ml 酶结合物。常温 摇床震荡30min。5. 清洗15min用枪头吸去槽内液体，在摇摇床上用1.5ml 清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5 分钟。6. 加底物溶液，反应10min吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5 ml 底物液。常温，摇床震荡10min。7
6、. 蒸馏水终止反应吸去槽内液体，用蒸馏水清洗3 次，1.5ml/次，1/次。风干15 min。（三）判读结果l 膜条干后，肉眼观察条带颜色强度；对照膜条上包被抗原位置，决定阳性抗体的种类。l 质控带出现强的颜色反应说明实验操作正确。膜条包被抗原的位置上出现的白色条带应判为阴性；阳性反应在抗原包被区呈兰色或紫色条带。l 抗原带着色与质控带强度相同为强阳性、中到较强为阳性、非常弱为可疑、无色为阴性。四、实验结果第8组条带如图1所示（从左至右数第一列）。结果判读示意图如图2所示。图1. 本次实验膜条条带 图2. 结果示意图根据结果示意图，本次实验在质控带上出现了深紫色条带，位于从上往下数的第一区域，
7、说明实验操作正确。本组膜条上出现强阳性的条带有三条，分别位于从上往下数的第二区域（1条）和第九区域（2条），条带呈深紫色。对照结果示意图，说明本实验所用患者血清的抗SS-A、抗Ro-52以及抗核糖体P蛋白抗体为强阳性。膜条上出现弱阳性的条带有一条，位于从上往下数的第八区域，条带呈淡蓝色。对应结果示意图，可知本实验所用患者血清的抗SS-B抗体为弱阳性。另外，膜条从上往下数第四区域出现一条白色条带，所对应检测的抗体为抗dsDNA抗体。根据结果判读原则，应判为阴性。五、分析与讨论（一）实验结果分析由上述结果判读发现，本实验所用患者血清的抗SS-A、抗Ro-52以及抗核糖体P蛋白抗体为强阳性，抗SS-
8、B抗体为弱阳性。SS-A抗原属于小核糖核酸蛋白，参与mRNA转变为有翻译活性分子。抗SS-A抗体常见于干燥综合症、（阳性率40%-80%）、系统性红斑狼疮（30%-40%）、原发性胆汁性肝硬化（10-20%）。抗Ro-52是抗SS-A抗体的其中一类（抗SS-A包括抗Ro52和抗Ro60两种自身抗体），常见于干燥综合征、系统性红斑狼疮。抗Ro-52如果阳性则提示复发或者优先于其它指标预警，起到预防提示作用。SS-B抗原是细胞核中作为RNA多聚酶III的辅蛋白，研究表明SS-B抗原决定簇是SS-A抗原的一部分，故SS-B抗体常伴随SS-A抗体一起出现。抗SS-B抗体几乎仅见于干燥综合症（阳性率40
9、%-80%）和系统性红斑狼疮（10%-20%）的女性患者中。抗核糖体P蛋白抗体（ARPA），则是系统性红斑狼疮的特异性抗体。SLE的活动性与ARPA的效价不具有相关性，对于有中枢神经系统症状、肾炎或肝炎的SLE患者，ARPA的阳性率与整个SLE人群基本相同。因此，根据不同抗核抗体所提示的疾病，以及该患者的抗核抗体谱，初步推断该患者患有自身免疫疾病，并且可能是系统性红斑狼疮（SLE）。若要明确诊断SLE，除了抗核抗体检测之外，还需要根据患者的临床表现（如皮肤狼疮、口鼻咽部溃疡），是否有肾脏、神经病变，是否有外周白细胞或淋巴细胞减少等信息，来进一步判断。在美国风湿协会（ACR）提出的SLE分类标准
10、中，需同时根据临床分类标准和免疫学标准作出诊断。（二）关于实验操作及结果判读的讨论本次实验的膜条背景较浅，利于结果的判读。有资料显示，在清洗时间一定的情况下，欧蒙印迹法中使用的摇床类型对于背景颜色有所影响，优先使用垂直振荡的摇摆摇床。若使用水平振荡摇床，由于液体受力作用向两侧集中，形成典型的“哑铃状”液体分布，可能使得膜条中部的抗原和抗体反应性下降，或者膜条洗涤不充分，导致膜条背景加深，影响实验结果判读。作为核酸分子，dsDNA抗原与其他蛋白质抗原具有完全不同的带电荷能力。因此，dsDNA抗原包被的位置不易与血清样本中的其他物质结合。当样本为dsDNA阴性时，抗原包被区域反应较弱或者无反应，而同一膜片上的其它区域由于吸附少量杂质导致背景加深，从而形成dsDNA条带发白的现象。出现上述实验结果时，样本可判断为明确可靠的阴性结果。【参考资料】王莉等, 抗Ro52抗体和抗Ro60抗体的临床应用价值探讨. 华西医学, 2014. 29(05): 第879-882页.李圣楠与黄慈波, 系统性红斑狼疮的诊断治疗进展. 临床药物治疗杂志, 2010(01): 第6-10页.王炜玮等, 欧蒙免疫印迹法在实验操作中常见问题处理及结果评价. 山西医药杂志, 2015(05): 第521-523页. 6 / 6
