《1630编号荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍 [兼容模式]》由会员分享，可在线阅读，更多相关《1630编号荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍 [兼容模式]（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2012年5月30日星期三 荧光定量荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍实验流程及所需试剂耗材介绍 南京润亚 宗雅冬 南京润亚 宗雅冬 实验流程：实验流程： 一、一、RNA的提取的提取 二、反转录（二、反转录（RT-PCR） 三、荧光定量三、荧光定量PCR（qPCR） 四、数据分析四、数据分析 实验注意事项：实验注意事项： 一、一、RNA的提取的提取 实验方法：异硫氰酸胍异硫氰酸胍-酚酚-氯仿（三试剂）单步总氯仿（三试剂）单步总RNA提取方法提取方法Trizol法法 实验所需试剂：推荐推荐BIO-RAD的的AurumTM基于膜总基于膜总RNA试剂盒 或 试剂盒 或PureZolTMRNA分
2、离试剂分离试剂 AurumTM总总RNA小型试剂盒小型试剂盒PureZolTMRNA分离试剂分离试剂 可以从广泛的样本，如培养细胞、细菌、酵母PureZolTMRNA分离试剂操作是Chomczynski 动物和植物组织中，提取无DNA污染的总RNA。试和Sacchi的快速、广泛使用的有效RNA分离方法基 剂盒采用严格配比的含有异硫氰酸胍和巯基乙醇的试础上改进而得。 PureZolTMRNA分离试剂是一种 剂，高效裂解样品并快速灭活RNA酶，然后通过离心苯酚和促溶剂异硫氰酸胍的液相混合物，简单的 或抽真空对离心柱硅质膜上的RNA进行纯化。这个试一步法就可以高效地完成细胞和组织溶解、去除 剂盒也可
3、以用于RNA净化和脱盐。RNA蛋白和灭活的内源核酸酶。DNA和蛋白通过 液相分层，有效地与RNA分离。 形式：小柱过滤（抽真空或离心）形式：单一有机溶液 分离方法：硅质膜分离方法：有机提取 形式：小柱过滤（抽真空或离心）形式：单一有机溶液 分离方法：硅质膜分离方法：有机提取 * * RNA提取实验结束后，请验证提取实验结束后，请验证RNA的纯度和完整性：的纯度和完整性： 1、OD260/OD280=1.82.0，表示RNA质量好，没有蛋白和苯酚的污染。 2、通过琼脂糖凝胶电泳来验证RNA是否降解 二、反转录二、反转录 实验所需试剂：推荐推荐BIO-RAD iScript cDNA Synthe
4、sis Kit 该试剂盒组成该试剂盒组成 优化好的优化好的5iScript反应混合液反应混合液Mix除除RNA模板以外所需所有成分的反转录酶混合液模板以外所需所有成分的反转录酶混合液 缓冲液纯化的缓冲液纯化的iScript RNase H加加MMLV反转录酶反转录酶 Oligo(dT) 防止防止RNA模板非选择性降解的模板非选择性降解的RNase抑制剂 随机引物 抑制剂 随机引物 dNTP 稳定剂和增强剂稳定剂和增强剂 iScript cDNA 合成试剂盒的特点合成试剂盒的特点 试剂中既有试剂中既有 oligo(dT)，也有随机引物，也有随机引物保证各种保证各种RNA模板均能正常反应 预混的优
5、化好的组分 模板均能正常反应 预混的优化好的组分使操作非常便捷，减少了交叉污染，也减少了操作误差， 节约了时间 优化的反应条件，高的反转录效率，宽的 使操作非常便捷，减少了交叉污染，也减少了操作误差， 节约了时间 优化的反应条件，高的反转录效率，宽的RNA模板范围模板范围100fg-1ug 带有高活性的带有高活性的iScript RNaseH+MMLV反转录酶和用于保护反转录酶和用于保护RNA模板的模板的RNase抑制剂 ，满足不同用户需求 抑制剂 ，满足不同用户需求 Sensitive detection from 1 pg to 1mg of input RNA iScript cDNA
6、Synthesis Kit，BIO-RAD To a 0.2-ml tube add: 4 ul 5X cDNA Synthesis System 1 ul iScript enzyme mix x ul nuclease-free water x ul RNA sample 20 ul final volume SuperScript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen To a 0.2-ml tube add: 0.5 ul oligo(dT)12-18, 500 mg/ml 0.5 ul Random hexam
7、ers, 50 ng/ml 2 ul 10X buffer 4 ul 25 mM MgCl2 1 ul 10 mM dNTP 2 ul 0.1M DTT 1 ul RNaseOUT (40U/ml) 1 ul SuperScript II RT (50 U/ml) x ul DEPC-treated water x ul RNA sample 20 ul final volume iScript cDNA 合成试剂盒合成试剂盒试剂成分比较试剂成分比较 iScript cDNA Synthesis Kit 5 min at 25oC 30 min at 42oC 5 min at 85oC Ho
8、ld at 4oC Total time: 45 minutes With iScript just set-up the thermal cycler and walk away! SuperScript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen 5 min at 65oC Quick chill on ice Add more items Mix and incubate for 2 min at 42oC Add SuperScript enzyme Incubate for 50 min at 42oC Heat k
9、ill 15 min at 70oC Total time: 85 to 90 minutes With SuperScript, youre tied to the bench AND youll be waiting for your cDNA longer! iScript cDNA 合成试剂盒合成试剂盒Protocol 比较比较 市面上几款反转录试剂对比市面上几款反转录试剂对比 Poor sensitivity even though its protocol time is only 25min! Protocol Time Comparison Bio-RadQuantaInvit
10、rogenInvitrogenABIStratageneQiagen iScriptqscriptSuperscript III for qPCR VILOHigh- capacity kits Affinity Script Quantitect Step 1 - Priming25C 5 min 22C 5 min 25C 10 min 25C 10 min 25C 10 min 25C 10 min Step 2 - Incubation42C 30 min 42C 30 min 50C 30 min 42C 60 min 37C 120 min 42C 55C 60 min 42C 1
11、5 min Step 3 - Denaturation 85C 5 min 85C 5 min 85C 5 min 85C 5 min 85C 5 sec 70C 15 min 95C 3 min Step 4 RnaseH treatment 37C 20 min Step 5 Total time40 min40 min65 min75 min135 min85 min20-25 min 数据来源：中科院遗传与发育研究所数据来源：中科院遗传与发育研究所 使用机型：使用机型：Bio-Rad CFX96 对比产品对比产品：Bio-Rad公司公司iScript cDNA synthesis ki
12、t，Invitrogen的的superscript III，Promega的的GoScript，Roche的的Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit 反馈信息反馈信息：使用者首先对总RNA进行10倍梯度稀释（1ug,100ng,10ng,1ng），再 分别使用不同公司的产品做反转录，然后用Bio-Rad CFX96进行定量实验，定 量试剂为Bio-Rad公司的SsoFast EvaGreen超混液，目的基因为actin。结果如下 图，从上往下分别为Bio-Rad，Invitrogen，Promega和Roche产品的结果。在理 想情况下，试剂
13、如果保持一致的反转录效率，那么最终定量结果的标准曲线斜 率应该为-3.33。从上图结果可以看出，Bio-Rad产品的斜率为-3.526，最为接近- 3.33，说明该产品在不同浓度的样品间反转录效率保持的最为一致。而反转录 效率的一致性是对RNA准确定量的前提和基础。 客户使用情况反馈客户使用情况反馈 客户使用情况反馈客户使用情况反馈 Bio-Rad公司公司iScript cDNA synthesis kit与其他公司同类产品比较与其他公司同类产品比较 Bio-Rad Invitrogen 扩增效率扩增效率=92.1% R2=0.981 斜率斜率=-3.526 扩增效率扩增效率=78.0% R2
14、=0.994 斜率斜率=-3.994 Promega Roche 客户使用情况反馈客户使用情况反馈 扩增效率扩增效率=84.4% R2=0.972 斜率斜率=-3.762 扩增效率扩增效率=76.6% R2=0.933 斜率斜率=-4.047 另外，实验人员将Bio-Rad和Invitrogen的产品做了单独的对比（如上图），红色 为使用Bio-Rad试剂反转录后样品的定量结果，蓝色为Invitrogen产品的结果。从上图 可以看出在较高模板浓度的时候，二者Ct出现的早晚相似，而在较低模板浓度时， iScript 的Ct值要比Invitrogen SuperscriptIII提前，说明iScr
15、ipt 在低浓度时反转录效率更 高。 因此，Bio-Rad iScript产品不仅可以保持不同浓度样品间反转录效率的一致性， 而且在模板浓度较低时，反转录效率更高（相比Invitrogen产品） 客户使用情况反馈客户使用情况反馈 三、荧光定量三、荧光定量PCR反应反应 实验方法：染料法：染料法 实验所需试剂：推荐：推荐BIO-RAD Ssofast EVA Green SuperMix定量试剂定量试剂 实验所需耗材：推荐：推荐BIO-RAD光学级的八联管光学级的八联管+八联管盖子及八联管盖子及96孔板和封膜孔板和封膜 SsoFast EvaGreen Supermix 可以提供什么可以提供什么
16、? 快速快速 qPCR （新一代的酶）（新一代的酶） 高灵敏度高灵敏度 qPCR (新一代染料新一代染料) 对多种对多种PCR抑制剂的抑制剂的高耐受度高耐受度 快速快速qPCR的实现的实现专利的专利的SsoFast 酶酶 SsoFast 酶增强了持续合成 能力 Sso7d from Sulfolobus solfataricus (硫磺矿硫化叶菌 ) 7kD, 63 aa. 热稳定性热稳定性 (Tm 90C) 无序列偏好无序列偏好 结合到结合到 dsDNA (3-6 bp/protein molecule) 单体单体 快速快速qPCR实验数据实验数据 Target: 18S cDNA from human spleen PCR efficiency = 101.8%, r = 0.997 PCR run time (cycling) = 29minutes 1 second anneal/extend 10 ng (10-9)100 ag
