《花药和花粉的培养课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《花药和花粉的培养课件（80页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二节 花药和花粉培养,概念及意义,花粉及小孢子培养,花药培养,一. 概念及意义,花药的结构,花药是产生花粉的主要部分，一般由四个花粉囊组成（也有两个）分左、右两半，中间由药隔相连，从花丝通入一条维管束与药隔相连，（主要提供养料，水分）囊外由囊壁包围，内生许多花粉粒，花粉粒（小孢子）成熟后，同一侧的隔壁消失而上，下连通。花药开裂（纵，横，孔，瓣裂）花粉粒散出，开始传粉。,花药的发育,幼嫩细胞,孢原细胞,初生壁细胞,造孢细胞,花粉母细胞,纤维层,中层（逐渐消失）,绒毡层（逐渐消失）,平周 分裂,花药的起源：最初在花托上产生雄蕊原基成为早期的花药顶端发育：外为一层原表皮细胞以后发育成表皮内为形状相
2、似具有高度分裂能力的薄壁细胞，由于四个角隅细胞分裂速度快而形成四棱的外形即花药的雏体。每棱的表皮下出现一个或几个体积较大的细胞称为孢原细胞，经常平周分裂产生二层： 周缘细胞紧贴表皮又称初生壁细胞，以后发育变化与表皮一起构成花粉囊的壁层。造孢细胞，有丝分裂形成花粉母细胞花药中部细胞分裂分化为药隔和维管束。,花粉粒的形成,花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养） 花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养）,两者的共同点是利用花粉（小
3、孢子）染色体数目的单倍性，培育单倍体植株，这是花药和花粉培养技术被广泛应用于植物遗传育种的主要原因。,2个概念,染色体组 (Genome),一般地说，像生殖细胞中的一组大小、形状各不相同的染色体就叫一个染色体组。 一个染色体组中含有的染色体数一般用 X 来表示，例如人体的一个染色体组可以表示为 X=23。,体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体。,单倍体（Haploid）,如：普通小麦为六倍体，体细胞中有六个染色体组，而以它的花粉培养出的单倍体植株的细胞中就含有三套染色体组。 只有二倍体生物的单倍体才是一个染色体组。所以，只要是由配子发育成的个体，无论其体细胞中含有几组染色体均叫单倍体。,di
4、ploid 植物其haploid即为monoploid 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 水稻 2n = 2x = 24 n = x = 12 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid植物其haploid为dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 陆地棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 26 hexaploid植物其haploid为triploid 普通小麦2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid植物其haploid为tetraploid 草莓 2n = 8x = 5
5、6 n = 4x = 28,生物体细胞中的染色体数一般用 2N 表示，配子中的染色体数用 N 表示，如甘蓝体细胞中的染色体数为2N = 18，雄配子体和雌配子体的染色体数为 N = 9。,单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点： 1、体细胞染色体数减半 2、生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 3、雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。,单倍体的应用潜力 1 、迅速获得纯合型材料，缩短育种年限 2、获得育种中间材料 3、与诱变育种相结合可以提高诱变频率 4、与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义 5、作为遗传工程受体更为有效 6、用作基础遗传研究的各个领域,二.花药
6、培养,首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari (1964,1966)。目前已有300多种植物花药培养成功。 目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。 我国通过花药培养途径曾经培育出大面积的水稻品种“寒花早”、“中花8号”等，小麦品种“京花1号”。同时还获得一大批具有育种价值的单倍体系。,花药培养的基本程序是： 外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养,外植体选择,供试材料的遗传背景 通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。 同一植
7、物的不同类型、不同品种对花药培养的反应也是不同的。,供试材料的生理状态 在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。,花粉的发育时期 四分体 小孢子 单核花粉 双核花粉 最适期,Sunderland (1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察： 花粉发育时期 胚状体诱导频率() 减数分裂期 0 单核早期 14 单核晚期 40 双核早期 55,花药预处理,大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。 烟草、茄子 35C 72小时 水稻 10C 1014天 柑橘 3C
8、 510天 马铃薯 4C 48小时,低温处理的作用： 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；增加有效存活的花粉数量，使较多的小孢子完成配子体到孢子体发育类型的转变。,培养基,培养条件,培养,培养基,花药培养常用的基本培养基：MS（Murashigc & Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。 附加成分：蔗糖；激素。,蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供C源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。 番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度（） 2 3 4 6 1
9、0 13 17 诱导频率（） 5 10 12 18 25 45 8,花药培养常用的激素有： 细胞分裂素类： BA 6-benzyladenine KT kinetin Zeatin 生长素类： NAA naphthalene acetic acid I A A indole-3-acetic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid,高秀云等对茄子的研究表明： MS2,4-D0.5mgl-1KT 1mgl-1 n 93.8% 2n 6.2% MS2,4-D 2mgl-1 KT 1mgl-1 n 4,1% 2n 35.9% 高浓度的2,4-D主要诱导花药
10、形成愈伤组织，而不能形成胚状体，同时，高浓度的生长素可能启动了花药壁等二倍体组织细胞分裂，从而抑制了花粉细胞分裂，从而增加了二倍体细胞发育的机会。,花药和花粉培养中单倍体形成的途径,通过胚状体形成单倍体植株,胚状体发育途径,部分花药通过胚状体途径形成小植株,烟草花药培养,通过胚状体途径再生形成小植株,烟草花药培养,胚状体发育途径,芸苔属小孢子培养,通过愈伤组织形成植株 植株来源 倍性 细胞类型 embryoid n 单个花粉粒 callus n / 2n / 2n+ 单个或多个花 粉粒、花粉细胞 与花药壁细胞等。,愈伤组织发育途径,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,水稻花药培养,水
11、稻花药培养,花药培养不经愈伤组织直接产生胚状体是最理想的方式，这样可免去愈伤组织和生根阶段。但多数情况是产生愈伤组织，这时要用提高细胞分裂素，降低生长素甚至不用生长素的分化培养基诱导分化产生芽。,培养条件,温度 -不同植物对温度的要求不同，如： 柑橘在20C以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到2125C时便会有胚状体形成，而当温度提高到26 以上时又完全不能形成胚状体。 -油菜若将接种后的花药在30 条件下培养23天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在33C条件下培养35天，可提高成愈率和绿苗率。 光照 -先弱后强,关于药壁因子,Sunderland（1978）明确提出
12、了药壁因子作用的假设。 -组织学研究证实了花药壁在诱导花粉胚中起着关键作用，在烟草中，只有原来贴着花药壁的花粉粒才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有在药室外围紧靠绒毡层的花粉才能够发育成花粉胚。,花药培养生长过程,(a) Anther at the onset of the culture. (b) Anther after 6 days in culture. (c, d) Embryos emerging from the anthers after 30 days in culture, showing roots (c) and shoots (d). (eg) Plantlets
13、 with cotyledons (e) and with leaves (f, g) subcultured in growing medium. (h) 80-day-old regenerated haploid plant from anther culture (left-hand side) and a diploid control of the same age (right-hand side).,三.花粉与小孢子培养 习惯上，把处于四分体到单核早期的花粉称小孢子。进入单核以后则称为花粉。,花药有药壁(2n)、药隔(2n)、花粉(n)等，因此，再生植株有可能来自药壁(2n)、
14、药隔(2n)、或起源于数个花粉(n)的嵌合体。 游离花粉粒培养，再生植株为纯合体。,材料的选择（一般是四分体到单核早期）、预处理、消毒、培养基以及再生植株的染色体加倍等与花药培养基本相同。 不同之处：花粉分离收集及培养方式,花粉分离收集： 由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法： 1）花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。 2）人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。 3）机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。 释放的花粉粒 尼龙网（孔径2060um）过滤，除去药壁等组织 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。,培养方式： 一般以液体
15、培养（花粉密度调至104-105/ml），形成愈伤组织或胚状体后转入固体培养基。 直接培养：直接取新鲜花药的花粉粒进行培养的方法 （培养基中可添加花药提取液）。 预培养：将花药先悬浮培养2-4天（50个花药/5ml）， 再挤出花粉，经离心洗涤纯化后悬浮培养。 哺育培养：将在合适培养基上培养裂开的花药作为哺 育组织，将预培养的花粉接种在其中的方法。,看护培养：将花药水平放于固体培养基上，在其上覆 盖小圆形滤纸，在滤纸滴加0.5ml含10个花粉 粒的悬浮液滴的培养方法。 微室培养：将一滴花粉悬液滴在盖玻片上，在翻过来 放在凹穴载玻片上，盖玻片四周用石蜡密封。 双层培养：固相和液相双层培养。,A:
16、NLN培养基过滤灭菌 B: 花蕾研磨 C: 过滤小孢子 D,E: B5悬浮 F: 离心 G: NLN悬浮 H: 胚胎发生 I: 植株再生,小孢子培养的优越性主要体现在以下几个方面： 排除了药壁、药隔、花丝等体细胞组织的干扰，获得的再生植株都是来源于单倍体的小孢子； 花药培养中，有时会因花药中的某些物质而影响小孢子的启动分裂，而小孢子培养则不存在这种问题； 小孢子培养中，由于小孢子是游离的单倍体细胞，除不受等位基因影响外，能均匀地接触外部环境条件(如化学、物理诱变)，因此是研究转化和诱变的理想材料； 便于系统观察小孢子在离体条件下的生长发育过程，是研究发育极好的材料体系： 小孢子培养从每个花药中能获得更多的再生植株。,四、花药和花粉培养中雄核发育的途径及 雄核发育诱导 1、
