《色谱分析法概述分析化学课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《色谱分析法概述分析化学课件（95页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、色谱分析法概述,广西医科大学药物分析教研室,2020/9/29,2,色谱法chromatogrphy,是一种重要的分离、分析技术,混合试样分离单组分 检测定性、定量分析,2020/9/29,3,色谱法的创始人 俄国植物学家 茨维特(M.Tswett),1903年月日在华沙自然科学学会生物学会上，他宣读了论文：On a new category of adsrption phenomena and their application to bichemical analysis. 年后，命名此法为chramatography ，多年后才得到应用,色谱法的由来,在茨维特的实中： 装有CaCO3的玻
2、璃管 色谱柱 CaCO3 固定相 纯石油醚 流动相,色谱法的由来,在该实验中，碳酸钙上混合色素被分成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分成不同色带的光谱现象一样，因此茨维特把这种现象称为色谱，相应的分离方法称为色谱法（色层法，层析法）,2020/9/29,6,2020/9/29,7,Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M. 1948年 Nobel 化学奖 1952年 Nobel 化学奖 吸附色谱与电泳 分配色谱,2020/9/29,8,色谱法是一种分离技术; 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配
3、过程。 其中的一相固定不动，称为固定相; 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。,1、色谱法的定义,色谱法定义：利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如溶解性、吸附力、分子形状及大小、极性、分配系数等）而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,2020/9/29,9,2、色谱法的特点,(1)分离效率高 复杂混合物，同系物、异构体、手性异构体。 (2) 灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 (3) 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 (4) 应用范围广 (5)不足之处：被分离组分的定性较为
4、困难。需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS,2020/9/29,10,1931年 库恩 奥地利化学家 胡萝卜素植物色素分离 20世纪30年代 离子交换色谱建立 1940年 吸附色谱与电泳相结合 1941年 分配色谱创立 1952年 气相色谱法建立 1968年 高效液相色谱法建立 1975年之后 离子色谱、超临界流体色谱、高效毛细管电泳、场流动分级分离,2020/9/29,11,Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M. 1948年 Nobel 化学奖 1952年 Nobel 化学奖 吸附色谱与电泳 分配色谱,2020/9/29,12,色
5、谱法的特点,优点：“三高”、“一快”、“一广”,缺点：,2020/9/29,13,第一节色谱过程的基本原理,一、色谱过程 二、色谱流出曲线和有关概念 三、分配色谱与色谱分离,1.互不相溶的两相（流动相、固定相）； 2.被分离组分在两相之间作相对运动,一、色谱过程,2020/9/29,15,色谱分离过程实验,色谱柱,色谱,混合物,固定相,流动相,色谱法实质是分离,分离依据： 各组分在两相之间作用力不同(吸附能力分配系数离子交换能力大小排阻能力其他亲合作用) 各组分差速异行分离,一、色谱过程,填充柱分配色谱分离过程,一、色谱过程,以吸附色谱为例 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系
6、数不同 差速迁移 分离,2020/9/29,18,A与B两组分在色谱柱内： 吸附解吸再吸附再解吸向下移动。 由于A、B二组分存在着理化性质的差异，因而吸附剂对它们的吸附能力不同，在柱中随流动相迁移的速度也就不同。经一段时间后，两组分就可以彼此分离。 如果吸附剂对A吸附能力弱 则A易被流动相洗脱 结果A先流出色谱柱。,2020/9/29,19,差速迁移固定相对被分离各组分有不同的吸附（or溶解）能力，而各组分在流动相中又有不同的溶解度，导致它们在柱内的移动速度不同由（开始）本来只有微小差异的各组分，通过成千上万次的吸附（溶解）解吸（分配），各微小差异累加起来，最终达到各组分的完全分离,一、色谱过
7、程,2020/9/29,20,第一节色谱过程的基本原理,一、色谱过程 二、色谱流出曲线和有关概念 三、分配色谱与色谱分离,2020/9/29,21,二、色谱流出曲线和有关概念,色谱流出曲线和色谱峰 色谱流出曲线 基线 色谱峰 对称因子,2020/9/29,22,一流出曲线和色谱峰,色谱图 被分析试样从进样开始，经 色谱柱分离，到各组分全部流过检测器 在此期间所记录下来的响应信号随时间而变化的曲线（分布的图像），称为色谱流出曲线或色谱图。,基线 在色谱操作条件下仅有流动相通过检测器时，反映检测器噪声随时间变化的曲线。 稳定的基线是一条直线。,色谱峰 在一定色谱条件下，组分通过检测器时，响应信号随
8、时间而变化的曲线称为色谱峰。 色谱过程按近理想条件和分配系数恒定时的流出曲线为对称的高斯分布曲线，对应的高斯分布函数为：,色谱流出曲线和色谱峰,2020/9/29,26,不正常色谱峰有两种：判断一个色谱峰是正常还是不正常，用fs衡量：(拖尾峰与前延峰) fs 0.05h2A=(A+B)/2A fs =0.95 1.05为对称峰 0.95 为前延峰 ； 1.05 为拖尾峰.,2020/9/29,27,色谱保留值 表明色谱峰在色谱图中的位置（可用时间t、体积V、距离d表示）。它是由色谱分离过程中的热力学因素所决定的。,2020/9/29,28,保留值的定义 1.保留时间 从进样开始到色谱峰最大值出
9、现时所需的时间,2020/9/29,29,保留值的定义 2.死时间 不被固定相保留的组分(K=0)，从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间 。 实际上为流动相流经色谱柱所需要的时间：,柱长（cm),流动相平均 线速度(cm/s),2020/9/29,30,保留值的定义 3.调整保留时间 组分的保留时间与死时间之差,2020/9/29,31,保留值的定义 4.保留体积 从进样开始到色谱峰最大值出现时所需通过的流动相的体积 5.死体积 6.调整保留体积,在LC中为实测值（mL/min),在GC中为校正到柱稳住压下 的平均流速,2020/9/29,32,7.相对保留值 某一组分与基准物质的调整保留
10、值之比：,1.峰高 从色谱峰顶点到基线的距离,峰的形状,色谱峰区域宽度 两个拐点E和F之间的距离为 EF= ，分别位于态 处。,标准差（）：正态分布曲线上两拐点间距离之半,区域宽度 2.半峰宽 峰高一半处的宽度GH,2020/9/29,36,3.峰宽（）通过色谱峰两側的拐点作切线，在基线上的截距称为峰高 或1.699W1/2,4.峰面积 A 色谱峰与基线延长线所包围的面积，精确计算时,2020/9/29,37,分离度（R）: (tR2 - tR1) 当R1.5时，两个组 (W1 + W2) 分可完全分离。,W1,W2,tR1,tR2,R =,（五）分离度（）,2020/9/29,38,计算公式
11、为： R值越大，相邻两组分分离得越好理论证明：两峰分离程度 0.75 50%0.80 89%1.00 98%1.50 99.7%,2020/9/29,39,2020/9/29,40,a. 色谱峰个数 判断试样中所含组分的最少数 b. 色谱保留值 定性 c. 色谱峰面积或峰高 定量 A = K C d. 保留值与峰的宽度 评价柱分离效能依据 e. 两峰间距 评价两组分能否分离,（4）色谱图的信息,2020/9/29,41,三、分配色谱和色谱分离,2020/9/29,42,（一）分配系数和容量因子,分配系数（）: 是指在一定的温度和压力下，达到分配平衡时,组分在固定相（S）和流动相（m）中的的浓度
12、（C）之比。,2020/9/29,43,K的影响因素,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。,2020/9/29,44,2.保留因子,在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,容量因子不仅与温度和压力有关，而且还与固定相和流动相的体积有关,保留因子也称： 容量因子(capacity factor)；容量比(ca
13、pacity factor)；,2020/9/29,45,1. 分配系数与保留因子都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 3.保留因子可以由实验测得。,2020/9/29,46,分配系数和容量因子与保留时间的关系 设流动相的线速度为，组分的速度为，二者之比称为保留比： 在定距展开中， tR， t因此：,2020/9/29,47,死时间t近似于组分在流动相中的时间t而溶 质分子只有出现在流动相中时才能随流动相前移，故 保留比与溶质分子在流动相中的分数有关： 所以：,202
14、0/9/29,48,由式（16-15）和式（16-16）得： 或 上二式叫色谱过程方程，表示保留时间与分配系数 （）及容量因子（）的关系,2020/9/29,49,由式（16-17）还可以得： 容量因子（）可通过实验测得容量因子表示 组分与固定相的作用，大则保留时间长,2020/9/29,50,（三）色谱分离的前提 设组分与的混合物通过色谱柱，若两者能 被分离，则它们的迁移速度必须不同，即保留时间 不等根据式（16-18）有： 两式相减得： 可见，若使必须使，即分配系 数不等是分离的前提,2020/9/29,51,第二节基本类型色谱方法及其分离机制,2020/9/29,52,色谱法分类,按两相
15、状态分,2020/9/29,53,色谱法分类,按分离过程机制分 吸附色谱法利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异 分配色谱法组分在两相中分配系数不同 离子交换色谱法利用离子交换原理 排阻色谱法利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用 等等,2020/9/29,54,色谱法分类,按操作形式分,吸附柱色谱 分配柱色谱柱色谱离子交换柱色谱 凝胶柱色谱2. 按操作形式分 纸色谱 平面色谱 薄层色谱,2020/9/29,55,色谱法分类,附：根据所使用的技术不同分 高效液相色谱(HPLC) 化学键合相色谱 衍生气相(液相)色谱 裂解色谱 顶空气相色谱 色谱制备 色谱分析,2020/9/29,56,二、基本类型色谱法的分离机制,基本概念：固定相（s）；流动相（m）,（一）吸附色谱法 （二）分配色谱法 （三）离子交换色谱法 （四）空间排阻色谱法,2020/9/29,57,（一）、分配色谱法,要求： 固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互溶 载体惰性，性质稳定， 不与固定相和流动相发生化学反应 正相色谱流动相的极性弱于固定相的极性 反相色谱流动相的极性强于固定相的极性,2020/9/29,58,Stationary phase Mobile phase,分离机制
