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1、激光扫描共聚焦显微镜技术及应用 The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy,新疆地方与民族高发病重点实验室 曹薇薇,原理 2. 在生物医学中的应用 3. 样品要求,激光扫描共聚焦显微镜技术及应用,激光共聚焦扫描显微镜基本配置,ZEISS LSM510 META Confocal System,激光共聚焦扫描显微镜基本原理,激光共聚焦扫描显微镜基本原理,普通光学显微镜和共聚焦显微镜的比较,增加的部件 扫描模块 电子控制器 激光模块,激光扫描共聚焦显微镜,普通广视野光学显微镜,非共聚焦 / 共聚焦图像,广
2、视野,共聚焦,非共聚焦 / 共聚焦图像,激光共聚焦显微镜在同一时刻对样品中的一点成像 这一点的像在屏幕上显示为一个像素 为获得样品的二维图像，激发光的聚焦点必须在样品上移动,从点到二维图像,扫描镜驱动激发光束以线的方式移动 扫描过程中得到的像素构成最终的二维图像,聚焦光锥,样品,X/Y 图像,X,Y,通过激发光的水平移动（X/Y），得到样品中某一特定层面的二维图像 这一层面代表了样品中的一个光学切片 无物理接触的采集,要获得样品的三维信息，激发光聚焦点不仅要在XY方向上移动，还要在Z方向上移动 通常，在扫描一个XY平面后，通过载物台的垂直移动使激发光聚焦点在Z方向上移动 结果是一个三维数据序列
3、，包含着若干幅代表样品中不同光学切片的XY图像,X/Y/Z 序列,Z轴驱动,从点到三维图像,普通广视野荧光图像 样品的厚度大于物镜的焦深,扩展焦深,共聚焦显微镜获得的样品的光学切片 光学切片的厚度取决于共聚焦针孔的直径,一系列取自不同光学层面的的共聚焦图像，包含着整个样品的图像信息,扩展焦深,时间序列,时间序列记录（真实时间） 在线比率 内/外触发（4内4外） 荧光漂白程序 事件标记 像素时间 感兴趣区域/线的荧光强度平均值（在线或离线） 最大时间分辨率： 幅：5 fps by 512x512 或 77 fps by 512x32 线（ 512像素）： 2600 / sec. (0.38 ms
4、) 速度级别：13X2,Multifluorescence imaging,Multifluorescence imaging approaches are ideally suited to directly visualize relationships or interactions of molecules and other cell components in their natural context.,Use multiple markers simultaneously,FITC/Rhodamine 双标记： 同时激发和检测这两种染料时，一部分FITC的发射光进入了Rhoda
5、mine的检测通道（发射串扰）,多重荧光成像 串扰问题,bovine endothelial cells,同时的扫描,FITC,Rhod,merged,分步的多重扫描,串扰问题的解决方法之一 多重扫描（Multitracking）,这个问题可以通过按顺序分别激发和检测两种染料来解决 先决条件是：用于激发FITC的激发光波长对Rhodamine没有激发（无激发串扰）,原理 2. 在生物医学中的应用 3. 样品要求,激光扫描共聚焦显微镜技术及应用,confocal在生物医学领域中的应用,只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察 活细胞动态荧光测量：检测细胞内Ca+、K+、
6、H+等离子的动态分布及动态定量； 形态学研究：细胞结构、细胞骨架、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡，以及寄生虫和微生物表面和内部结构；中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类 分子生物学：原位杂交、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通，受体与配体相互作用,原理: 检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内, 被细胞内酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。,1. 活细胞内离子动态变化测量,细胞内游离Ca2+测量,激光扫描共聚焦显微镜可对单个细胞内离子（Ca2+、K+、N
7、a+、Mg2+、pH等）的动态变化做实时定量分析；能进行细胞生理信号的动态监测。,Ca离子时间序列,The new colocalization dialog Scattergram, image display and data table are interactively linked,Scattergram,Data table,Image display,Tools,2 Quantitative Colocalization Analysis,3. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传
8、递,用GFP 标记HeLa細胞的组蛋白(histone)。 用FRAP来观察组蛋白的扩散速度（使用488nm激光）,FRAP,4. 荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 大分子构象的改变,I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。,供体荧光素 受体荧光素,1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm 2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠,II.荧光能量共振转移的条件,488nm 520nm 650nm,供
9、体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3),供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3),FITC/TRITC, Cy3/Cy5, CFP/YFP,Fluorescence Intensity,Time,检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。 应用 受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离 大分子构象的改变,III. 常用荧光共振转移探针对,Cell-FITC,Hela Cell Tubulin(FITC+TRITC),Hela Cell Tubulin(FITC+TRITC)-Z-Stack,HEK C
10、ells-3D,Volvox Z-Stack,拟南芥细胞：叶绿体，线粒体,Co-localization,FITC+Sytox Green,Zebrafesh Embryo Unknown,激光扫描共聚焦显微镜技术及应用,原理 2. 在生物医学中的应用 3. 样品要求,标本： 1.经荧光探针标记(单标、双标、三标） 2.固定的或活的组织 3.固定的或活的贴壁培养细胞应培养在 Confocal专用小培养皿或盖玻片上 4.悬浮细胞，涂片或滴片后，用盖玻片封片,样品制备要求,样品制备要求,载玻片、盖玻片：载玻片与盖玻片的厚度应尽可能薄，玻面光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。 封裱剂：常用缓冲甘油封固。
11、需无自发荧光，无色透明。由于甘油的荧光亮度在pH为8.59.5时较亮，不易很快褪去，故常用甘油和0.5MpH为9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。,荧光探针的选择： 实验标本要求经过荧光染色后，才能进行激光扫描共聚焦显微镜观察和分析。应根据实验的要求选择合适的荧光探针，探针的选择应具有高灵敏度和高度的特异性。观察多重荧光标记时。应注意荧光的发射带是否重叠。同时还应注意实验标本的自发荧光与所测荧光信号的区分。,样品制备要求,激光共聚焦开放,时间：周二全天，需提前3-5天预约 地点：医学院主楼二楼203室 联系电话：2057882，13319935801 联系人：曹薇薇,Thank You!,
