质 粒 提 取 原理及步骤[汇编]

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1、质质 粒粒 提提 取取 原理及步骤原理及步骤 一、导论 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒 DNA， 这些方法都含有以下 3 个步骤： 1. 细菌培养物的生长。 2. 细菌的收获和裂解 3. 质粒 DNA 的纯化。 （一）细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生 长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如 pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准 LB 培养基中生长到对数晚 期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒 DNA。然而，较长一代的载体( 如 pBR322)由于不能

2、如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉 素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻 止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续 递增。这样，像 pBR类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒 的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素 g/ml) 已成为标准的操作、用该方法提取的质粒 DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工 作任务。 （二）细菌的收获和裂解 1 / 8 Remove Demo Watermark from 细菌的收获可通过离心来进行，而细

3、菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这 些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪 一种方法取决于个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒 DNA 的技 术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述 一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 1)大质粒(大于 15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于 蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和 EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入 SDS 一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出 来所需要的作

4、用力。 2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入 EDTA 后，有时还在加入溶菌酶后让细菌 暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线 状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件 恢复正常时，质粒 DNA 链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 3)一些大肠杆菌菌株(如 HB101 的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对 大量的糖类，当随后用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。 糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒 DNA 所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避 免质粒

5、DNA 内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如 HB101 和 TG1 等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 4)当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌菌株(endA+株，如 HB101) 中小量制备质粒时， 建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶 A，以后在温育(如用限制酶消化) 时，质粒 DNA 会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题 。 )目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获 得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒 DNA 的产量，而是要降低细菌 细胞在用于大量制备的溶液中所

6、占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为 费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量 细胞获得的质粒 DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒 DNA 的量大致相 等。 (三)质粒 DNA 的纯化 常使用的所有纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。 例如，用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体 DNA 就取决于溴化乙锭与线 状以及与闭环 DNA 分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与 D NA 结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状 DNA 的长度有所增加，作为补偿，将在闭环 质粒

7、DNA 中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继 续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每个碱基对大 2 / 8 约结合个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环 DNA 分了在含有饱 和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯溴化乙锭梯度平衡 离心已成为制备大量质粒 DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多 替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。 二、质粒 DNA 的小

8、量制备 质粒的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法 （一）细菌的收获和裂解 收获 ）将 2ml 含相应抗生素的加入到容量为 15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然 后接入一单菌落，于 30剧烈振摇下培养过夜。 ）将 1.5ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于 4以 12000g 离心 30 秒，将剩 余的培养物贮存于 4。 ）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与 真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离 细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。 碱裂解法 ）将细菌沉淀，所得重悬于 100l 用

9、冰预冷的溶液中，剧烈振荡。 溶液: 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L TrisCl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0) 溶液可成批配制，每瓶约 100ml,在 10lbf/in2(6.895104Pa) 高压下蒸气灭菌 15 分钟， 贮存于 4。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触 震荡，可使沉淀迅速分散。 ）加 200l 新配制的溶液。 溶液 0.2mol/L NaOH（临用前用 10mol/L 贮存液现用现稀释） 1%SDS 3 / 8 盖紧管口，快速颠倒离心管次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液 接触。不要振荡，将离心

10、管放置于冰上。 ）加 150l 用冰预冷的溶液 溶液 5mol/乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液对钾是 3mol/L，对乙酸根是 5mol/L。 盖紧管口，将管倒置后和地振荡 10 秒钟溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将 管置于冰上分钟。 ）用微量离心机于 412 000g 离心 5 分种，将上清转移到另一离心管中。 ）可做可不做：加等量酚：氯念， 振荡混匀， 用微量离心机于 4 以 12000g 离心 分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于 一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的 DNA。

11、 ）用倍休积的乙醇于室温沉淀双锭 DNA。振荡混合， 于室温放置分钟。 ）用微量离心机于 4以 12 000g 离心分钟。 ）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的 液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液 面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附 于管壁的液滴。 ）用 1ml70%乙醇于 4洗涤双链 DNA 沉淀，按步骤 8）所术方法去掉上清，在空气中 使核酸沉淀干燥 10 分钟。 i. 此法制备的高拷贝数质粒（如f3 或 pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物 35g。 i

12、i如果要通过限制酶切割反应来分析 DNA，可取 1l DNA 溶液加到另一含l 水的微 量离心管内，加 1l 10限制酶缓冲液和单位所需限制酶， 在适宜温育 12 小时。 将剩余的 DNA 贮存于20。 iii. 此方法按适当比例放大可适用于 100ml 细菌培养物： 煮沸裂解 ）将细菌沉淀，所得重悬于 350l STET 中。 STET 0.1mol/L NaCL 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 5% Triton X-100 4 / 8 ）加 25l 新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,用 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

13、配制，振荡 3 秒 钟以混匀之。如果溶淮中 pH 低于 8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。 ）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为 40 秒。 ）用微量离心机于室温以 12 000g 离心 10 分种。 ）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。 ）在上清中加入 40l 5mol/L 乙酸钠（pH5.2）和 420l 异丙醇，振荡混匀，于室温放 置 5 分钟。 ）用微量离心机于 4以 12 000g 离心 5 分种，回收核酸沉淀。 ）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的 液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用 吸头接触液

14、面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过 抽真空除去附于管的液滴。 ）加 1ml 70乙醇，于 4以 12 000g 离心分钟。 10）按步骤 8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁 不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无 可见的液体（25）分钟。 11）用 50l 含无 DNA 酶的胰 RNA 酶（20g/ml）的 TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮 存于-20。 注：当从表达内切核酸酶的大肠杆菌株（endA+株，如 HB101 ）中小量制粒尤其 DNA 时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能

15、完全灭活内切核酸酶，以后在 Mg2+存在下温育 （V 中用限制酶时）质粒 DNA 可被降解。 在上述方案的步骤）之间增加一步，即用酚 ：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。 （二）质粒小量制备的问题与对策 裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们 实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题： ）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割，这几 乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用 酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层 析注纯化 DNA。 ）在

16、十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒 DNA 的现象。这几乎肯定是由 于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。 5 / 8 三、质粒的大量制备 （一）在丰富培养基中扩增质粒 许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效， 然而在带有 pMBl 或 ColEl 复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提 高产量至每 500ml 培养物 25mg 质粒 DNA，而且重复性也很好。 ）将 30ml 含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA 600 约 0.6)。培养基中应 含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。 ）将含相应抗生素的 500ml 或 Terrific 肉汤培养基（预加温至 37）施放入 25ml 对数晚期的培养物，于 37剧烈振摇培养 25 小时（摇床转速 300 转/分），所得培养物的 OD 600 值约为 0.4。 ）可做可不做：加 2.5ml 氯霉素溶液（34mg/ml 溶于乙醇），使终浓度为 170g/ml。 像 pBR322 一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的