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1、T-SPOT.TB诊断结核感染 临床应用进展,1,主要内容,结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用,2,主要内容,结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用,3,结核的现状,结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO统计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核。 我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上。,4,中国是结核感染高负担国家,患者人数占全球的14.3%，具体表现为“五多” 感染人数多5.5亿人感染过结核 患病人数多现有活
2、动性肺结核患者500万 潜伏感染人数多受限于检测条件较难统计，2009年流行病调查结果为总人口的44.5%（因采用PPD检测，假阳性较多） 新发患者多仅活动性肺结核2009年新发病患107万 死亡人数多13万/年,5,结核的传统诊断手段,结核菌素皮试： 低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。 低特异性：与卡介苗接种和其他环境分枝杆菌有交叉，易造成“假阳性”结果。 免疫学诊断 抗原、抗体（胶体金） 细菌学检查：常规培养：2月；快速培养：1周； 涂片阳性率取决于采集标本中细菌数量，不利于早期诊断。 病理学检查：阳性率低，对取材有较高要求，有创伤，对肉芽肿性病变需进一步鉴别。 分子生物学诊断
3、PCR 影像学检查,6,免疫学诊断,PPD皮肤试验,抗体检测,假阳性率高 48-72h读取结果,敏感性、特异性差,7,WHO关于血清学检测声明,2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）正式声明，要求禁止将血清学检测方法（抗原，抗体，蛋白芯片等）用于肺结核和肺外结核的诊断。,WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB. A substandard test with unreliable results TB can be w
4、rongly diagnosed A serological test for diagnosing active TB disease is bad practice Problems of misdiagnosis The inaccurate serological tests are costly Selling substandard tests with unreliable results,8,细菌学诊断,阳性率低 含菌量1万/mL痰液,需时4-6周,9,快速培养系统,1. BD BACTEC MGIT 960培养系统 2. BacT ALERT 3D培养系统,10,分子生物学诊
5、断,实时荧光定量PCR技术：HRM 线性探针耐多药检测技术：HAIN技术 基因芯片 PCR 电离质谱检测技术,11,病理学检查,阳性率低 对取材有较高要求，有创伤 对肉芽肿性病变需进一步鉴别,12,影像学检查,目前诊断活动性肺结核的重要手段，尤其是粟粒性肺结核 对潜伏性结核诊断价值不大 对肺外结核诊断价值不大,13,现有检测手段不能满足临床要求,假阴性：免疫力低下或HIV人群，新生儿、老弱人群，药物影响； 假阳性：BCG接种人群，其它分支杆菌感染，交叉污染 肺外的结核感染无法明确诊断 抗痨治疗疗效无法评价 无法排筛结核感染，造成生物制剂或移植手术治疗后病患免疫力下降，引发结核，形成医疗事故,1
6、4,主要内容,结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用,15,21世纪结核检测的重大突破,-干扰素释放实验（IGRAs)被商化（2006年），用于结核感染的检测 将结核菌特异性抗原加入含受试者的血液标本的培养基中进行孵化，如果受试者受到过MTB感染，那么被结核菌激活的记忆T细胞就会对这些特异性抗原产生反应，发生增殖分化并释放-干扰素 通过定量检测-干扰素的释放水平，来诊断MTB感染 T-SPOT.TB(结核感染T细胞斑点试验),16,17,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性T
7、细胞 当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰素 r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要的细胞因子,18,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,T-SPOT.TB技术： 利用结核杆菌感染者外周血单核细胞（PBMC）中存在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异抗原刺激后分泌r干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放r干扰素的T淋巴细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算出抗原特异性细胞的频率。,19,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,包,20,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,患者体内存在针对
8、MTB的效应T淋巴细胞,患者体内不含针对MTB的效应T淋巴细胞,21,T-SPOT.TB的临床意义,T-SPOT.TB高灵敏度,22,T-SPOT.TB的临床意义,23,T-SPOT.TB的临床意义,T-SPOT.TB高特异性 ESAT-6CFP 10均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域 仅结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）存在 RD1区基因 卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因（M.gordonae、M.kansasii、M.marinum、M.szulgai） T-SPOT.TB不会受卡介苗接种及其他分枝杆菌的影响,24,T-SPOT.TB的临床意义,25,T-SPOT.TB 的
9、高特异性与灵敏度，给临床准确、快速的诊断结果,特异性 美国FDA临床研究数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床研究数据：特异性94.1%(478/508) 灵敏度 美国FDA临床研究数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床研究数据：灵敏度95.3%(624/655),26,T-SPOT.TB的临床意义,基于结核抗原特异性T细胞向病变部位集中的特点， T-SPOT.TB的检测物已不局限于静脉血，支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等也可用于对肺内及肺外结核的诊断。 敏感性优于ADA、TB-DNA，约在62-75%，特异性无统计学差异。,27,T-SPOT.TB的临床意义,
10、在结核病治疗中的评价意义 效应T细胞随结核杆菌的清除而消失，其阴性及阳性结果可作为评估治疗效果的手段之一 。,28,T-SPOT.TB的缺点,仍有一定的假阳性及假阴性结果 实验结果是对结核感染的判断，阳性结果包括了活动性结核及潜伏性结核感染的可能，需要结合临床来确诊是否是结核病患者 不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床来判断,29,主要内容,结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用,30,病例1,患者，男，35岁 患者于一月前开始无诱因下出现高热、胸闷，动则气急，无咳嗽，咯血，盗汗 。 胸片：两肺（），右侧胸腔积液，心包积液 心超：心包积液 心包
11、穿刺：血性 诊断：肿瘤？结核？细菌感染？,31,检测结果,外周血T-SPOT.TB：阳性 心包积液T-SPOT.TB：阳性 诊断：结核性心包炎 治疗： INH、RFP、PZA、EMB、强的松 体会：诊断快速 心包积液结核培养 6周后报阳,32,病例2,患者，女性，60岁，浙江温州人 主诉：反复发热2月余，头痛2周伴意识障碍2天 外院头颅MRI见脑实质内弥漫性点状、结节状及环形病灶。 有皮肌炎史，外院予激素治疗,33,腰穿,压力250mmH2O，有核细胞420 x106/L，糖0.6mmol/L，蛋白1688mg/L，氯化物136mmol/L 隐球菌乳胶凝集试验：阴性,34,治疗：抗细菌+抗结核
12、,美罗培南、利奈唑胺、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇治疗，同时予甘露醇250ml q8h及地塞米松每天7.5mg。 2天后患者体温即平，意识障碍好转 脑脊液T-SPOT.TB：阳性 诊断：倾向结核性脑膜脑炎,35,五联抗结核,给予HRZE及左氧五联抗结核 2周后，CSF分枝杆菌快速培养：阳性 3个月后：,36,病例3,女性，14岁，初中学生 主诉：发热1月余 患者5月初无明显诱因下出现发热，Tmax：39，以午后为著。伴头晕、畏寒、盗汗，不伴寒战、咳嗽、咳痰、四肢肌肉痛、皮疹等，家人自行予退烧药（具体药物不详），体温可恢复正常，但午后体温仍反复 2013-05-24患者就诊，查血常规示：W
13、BC: 4.7x109/L， N:43.2% 。查尿常规示：WBC:8-10个/HP，Pro(+)。考虑为尿路感染，予头孢丙烯等抗感染治疗，但仍出现反复发热，病程中，患者无尿频、尿急、尿痛、腹胀、腹痛、腰痛等不适 2013-06-01予希刻劳0.5g及罗氏芬2.5g对症治疗后体温有所好转，但停药后体温仍上升 2013-06-09查肺CT示：左肺上叶炎性病变。增强CT示：左肺上叶炎性病变，左肺门及纵膈淋巴结肿大。B超示：左侧锁骨上、双侧腋窝（右腋下明显）淋巴结肿大,37,结核病的实验室诊断停留在上世纪50年代水平,38,入院后实验室检查,血常规：WBC:3.83x109/L, N:50.4%,
14、L:39.4%, M:9.9%, Hb:118g/L, PLT:231x109/L ESR：71mm/h。CRP：正常 尿常规（-） 自身抗体（-） 肿瘤标记物（-） T-SPOT.TB（+）,39,上腹部 增强CT,40,肺CT,2013-06-24肺CT(增强)：左肺上叶炎症，结核可能；纵隔内多发肿大淋巴结可能，淋巴结结核可能,41,淋巴结穿刺,右腋下淋巴结穿刺涂片 见大量淋巴细胞、少量凝固性坏死物、 上皮样细胞，结核性淋巴结炎可能,42,诊断,亚急性血源播散性结核病：肺结核、淋巴结结核、脾结核 抗结核治疗：HREZHEZS,43,潜伏性结核感染的筛查,接触活动性结核病患者,暴露程度不足，
15、结核杆菌被机体免疫力清除,没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被侦测 X-光/ CT 扫描显示正常 没有抗体应答 诊断困难 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）,机体被感染,受机体免疫力抑制 没有临床症状,终身处于感染状态,潜伏感染,有临床症状 具有传染性,结核杆菌可以通过涂片、培养检测出 胸部的 X-光或 CT 扫描显示异常 肺外结核难以诊断 (特别是儿童),活动性结核,5%,5%,再次激活,44,活动性结核与潜伏性结核,45,我国普通人群中LTBI流行率评估,46,小结,结核病在临床上仍不容忽视，但诊断仍存在难题 T-SPOT.TB（尤其是体液检测）大大提高了结核的诊断效率，缩短了结核诊断时间 T-SPOT.TB对我国潜伏性结核的筛查，结果更加可靠,47,谢谢,48,
