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1、医疗器械生物相容性,1,相关概念,生物相容性： 生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能。 医疗器械：制造者专门或主要设计成为下列目的应用于人体的，不论是单独使用还是组合使用的，包括使用所需软件在内的任何仪器、设备、器具、材料或者其他物品。 预期用于人体的任何材料或器械的选择与评价需遵循一定的评价程序。主要依据为：GB/T16886 ISO 10993 在设计过程中，应对衡量各种所选材料的优缺点和试验程序进行判断并形成文件。为了保证最终产品安全有效地用于人体，这一程序应包括生物学评价。,2,标准分类,医疗器材生物学评估架构与原则 第1部分：评价与试验 材料特性与实质对等 第7部分：环氧乙烷灭菌
2、残留量 第9部分：潜在降解产物的定性和定量框架 第13部分：聚合物医疗器械的降解产物的定性与定量 第14部分：陶瓷降解产物的定性与定量 第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量 第17部分：可沥滤物允许限量的建立 第18部分：材料的化学特性 第19部分：材料的物理化学、形态学和地形学特点,3,标准分类,具体实验 第2部分：动物保护要求 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验 第4部分：与血液相互作用试验选择 第5部分：体外细胞毒性试验 第6部分：植入后局部反应试验 第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验 第11部分：全身毒性试验 第16部分：降解产物和可溶出物的毒代动力学研究设计 第20部分
3、：医疗器械免疫学毒性试验原则和方法,4,开始,是否直接或间接接触？,获得材料的识别信息并应考虑化学表征（ISO 10993-18）,材料是否与市场上器械所用材料相同？,与人体接触是否相同？,是否有风险评定所需充分的论证和/或临床相关数据（化学和生物学）？,这些数据是否与接触记录和途径相关？,进行毒理学风险评定（附录B）,根据材料的化学性质和接触类别和时间对器械进一步评价,生物学评价完成,是,否,是,是,否,否,否,GB/T 16886.1 不适用,器械是否有相同的化学组成？,制造和灭菌是否相同？,生物学实验的选择（附录A）,试验和（或）豁免建议试验的论证,是否材料中所有化学物的充分的毒理学数据
4、？,这些数据是否适用于化学混合物？,是,是,是,是,是,是,是,否,否,否,否,否,医疗器械生物学评价流程,5,生物学评价试验的选择,6,第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验,遗传毒性试验：采用哺乳动物或非哺乳动的细胞培养或其他技术，测定由器械、材料和/或其浸提液引起的基因突变、染色体结构和数量的改变，以及DNA或基因的其他毒性。 体外遗传试验： 细菌基因突变试验 哺乳动物细胞基因突变试验 哺乳动物细胞诱裂性试验 体内遗传试验 啮齿动物微核试验 啮齿动物骨髓中期分析 哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验 注意： 所有体外试验结果均为阴性，为避免对动物的过度使用，通常不再论证并不宜再进行动物遗
5、传毒性试验。 若全部体外试验的结果均为阳性，则应进行体内诱变性试验，否则推定该化合物为诱变物。,7,第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验,细菌基因突变试验（AMES实验 his-his+ ） 鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his-）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。 某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶（S9），可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。 鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故
6、此法现广泛应用于致癌物的筛选。,8,AMES实验,测试系统：细菌 鼠伤寒沙门氏菌：组氨酸营养缺陷型 埃希氏大肠杆菌：色氨酸营养缺陷型 浓度设置： 阴性对照组/溶剂对照组；阳性对照组；受试物至少五个剂量组； 决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。 对原料而言：一般最高剂量组可为5mg/皿。 对产品而言： 有杀菌作用，最高剂量可为最低抑菌浓度， 无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液，最低剂量 为0.1g/皿。 方法： 平板掺入法（标准试验法） 预培养法（提高测试灵敏度） 点试法（预试验）,9,AMES实验-菌株特性鉴定,组氨酸需求 紫外线损伤修复缺陷 脂多糖屏障丢失（rfa）,R因子（
7、抗氨苄青霉素、抗四环素） 自发回变,10,AMES实验,平板掺入法,预培养法,11,AMES实验,结果观察和判断： 掺入法：以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定，如在背景生长良好条件下，受试回变菌落数增加一倍以上，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物为诱变阳性。 点试法的判定：如在受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落与空白对照相比有明显区别者，可初步判定该受试物为阳性，但应该用掺入法试验来确证。,12,第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验,哺乳动物细胞基因突变试验（小鼠淋巴瘤细胞试验MLA tk + tk - ） MLA是以抗药性的
8、出现作为观察突变指标 , 其小鼠淋巴瘤细胞株( L5178Y tk+/-3.7.2C)的tk基因产物为胸苷激酶(TK) 。该酶催化胸苷的磷酸化反应 , 生成胸苷单磷酸(TMP) , 进一步生成 DNA复制所必须的胸苷三磷酸 。 如果存在三氟胸苷(TFT) 等嘧啶类似物 , 则产生异常的 TMP , 而异常TMP 的存在将导致细胞死亡 。 如在被检物存在下 , 细胞对TFT发生抗药性 , 则说明 tk 基因发生突变 。试验细胞株的 tk+/-基因位于 11 号常染色体上 , 为杂合子基因 , 这样只需一侧的 tk + tk -即能对嘧啶类似物产生抗性 。,13,小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）,试验
9、系统：小鼠淋巴瘤L5178Y TK+/-细胞 方法： 软琼脂平皿法（soft agar method）在美国使用较多。在平皿中生长的抗性突变细胞集落呈近似正态分布，根据实验结果可计算克隆效率（cloning efficiency，CE）和突变率（mutation frequency，MF）等指标。 微孔平板（microwell method） （即96孔培养板）法在欧洲使用较多。在微孔中生长的抗性突变细胞集落呈Poisson分布，根据实验结果可计算接种效率（plating efficiency，PE）和突变率等指标。 优点：既能检测点突变，也能够检测出大的染色体损伤 缺点：自发突变率高，需要定
10、期清除自发突变。,14,Cells,Expression (2d),Chemical treatment (3h or 24h),Plating for PE0,Plating for PE2,Plating for TFTr,Incubation (12d),Colony counting and calculation,Incubation (12d),小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）,细胞集落形成率 , 即平板效率 ( Plating Efficiency, P E ) 的相对存活率( Relative Survival, RS) 作为细胞毒性指标 。,15,突变集落 在TK基因突变试验中，
11、经过TFT选择后长出的抗性细胞集落（即 tk-/-突变体）可分为两种类型，即大集落（集落）和小集落（集落）。 微孔平板法：大集落微孔直径的1/4 小集落微孔直径的1/4 软琼脂平皿法：大集落直径0.6mm 小集落直径0.6mm 大集落呈弥散性生长，其密度低；小集落呈集中性生长，其密度高。 一般认为大、小集落突变体是由于基因损伤的范围和程度不同所致。大集落突变体的基因损伤多仅局限于 tk 位点；而小集落突变体是由较大范围的染色体改变（染色体断裂、缺失、重组或分离异常等）所致。这是TK基因突变试验能够检出基因突变和染色体畸变两类终点，并能在一定程度上对二者加以区分的重要机理。,小鼠淋巴瘤细胞试验（
12、MLA）,16,试验结果的判定 各处理组的MF值呈浓度依赖性升高，判定为阳性； MF值 阴性对照值+126，判定为阳性。（微孔法中的GEF=99+27=126）,阳性对照参考值 其一，阳性对照组总诱导率IMF至少30010-6，其中小克隆IMF至少12010-6 其二，小克隆IMF至少15010-6 满足上述标准之一，并且阳性对照相对总生长率（RTG） 10%,结果评判,小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）,17,第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验,哺乳动物细胞诱裂性试验（体外哺乳动物细胞染色体畸变试验） 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂
13、（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。,18,体外哺乳动物细胞染色体畸变试验,测试系统： 中国地鼠卵巢（CHO）细胞株；中国地鼠肺（CHL）细胞株； 人外周血淋巴细胞 剂量设置 阴性对照组/溶剂对照组；阳性对照组；受试物至少三个剂量组； 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透分子浓度(osmolality)的改变。 最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝分裂指数（均应大于50%）。 对于那些相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5l/mL，5mg/mL或0.01mol/L。 对于相
14、对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是：当处理期结束时，在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。,19,体外哺乳动物细胞染色体畸变试验,方法： 细胞复苏、培养； 受试物处理； 加入秋水仙素，使细胞停止于分裂中期； 收获细胞，滴片 空气干燥，染色 处理条件： 包括代谢活化和非代谢活化条件 在处理后6和24小时收获细胞 代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时,20,体外哺乳动物细胞染色体畸变试验,读片分析： 有丝分裂指数毒性 染色体结构畸变 染色体数目畸变,21,a.染色单体断裂 b. 三辐射体 c. 染色体断片 d. 双着丝点染色体 e. 环状染色体 f. 无着丝点断片,
15、22,啮齿动物微核试验,微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。 最常用的是啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。以受试物处理啮齿类动物，然后处死，取骨髓，制片、固定、染色，于显微镜下计数PCE中的微核。 如果与对照组比较，处理组PCE微核率有统计学意义的增加，并有剂量-反应关系，则可认为该受试物是哺乳动物体细胞的致突变物。 采用大鼠或小鼠（610周） 分析骨髓中嗜多染红细胞中的微核，嗜多染红细胞是红细胞成熟的一个阶段，主核已排出，容易观察微核,23,微核是染色单体或染
16、色体的无着丝粒断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的细胞质内。,24,剂量设置： 阴性对照组/溶剂对照组； 受试物至少三个剂量组； 阳性对照组； 试验方法 给药临床拟用途径； 预试验中测定时相点，确定正式试验的采样时间； 收集骨髓细胞，离心，涂片，干燥，固定，染色,啮齿动物微核试验,25,读片：嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈淡桔红色。微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。 计数PCE/NCE（嗜多染红细胞/成熟红细胞）的比例反映毒性 计数含微核PCE的细胞百分率；,啮齿动物微核试验,26,第3部分 遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验,啮齿动物骨髓中期分析（哺乳动物骨髓染色体畸变试验） 本试验是一项致突变性试验，检测整体动物骨髓细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。使哺乳动物（如大鼠或小鼠）经口或其它适宜途径染毒，动物处死前用细
