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1、第七节 端粒与端粒酶,telomere and telomerase,端 粒（telomere）,是真核生物染色体末端的一种特殊结构 由端粒DNA和端粒蛋白质构成 作用：稳定染色体结构 防止染色体末端融合 保护染色体结构基因 避免遗传信息在复制过程中丢失,研究概况,端粒的发现,Mller将它定义为“telomere”，这是由希腊语“末端”（telos）及“部分”（meros）组成的,1938 Muller X-ray Drosophila,末端极少发生缺失和倒位 推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定. 并定名为Telomere,1941 B.McClintock 顶端缺失染色体易于融合
2、，而正常染色体不易连接。 推测染色体末端具有特殊端粒结构。,端粒的发现,1978，EH.Blackburn 利用四膜虫（Tetrahymena）揭示了端粒的初步结构 由几个核苷酸组成的 DNA 重复片段，富含G （TTGGGG）n，重复的次数由几十到数千不等,端粒DNA序列,四膜虫端粒的分子组成：,端粒 染色体DNA 端粒,人的端粒DNA序列 长约515kb 序列：（TTAGGG）n ，串联重复2千次左右,不同生物端粒DNA长度,酵母 200 400 bp 纤毛虫 36 bp 小鼠 5 80 kb 大鼠 150 kb,端粒结构,端粒酶的发现,72年，JD.Watson发现： DNA 聚合酶不能
3、够完整地复制线性染色质 5末端的引物脱落后，DNA聚合酶不能完成最后的复制，留下一个单链的间隙 如果这一间隙不能够被填充，染色体DNA将失去这一DNA片断 每经过一次复制、分裂，染色体就将丢失一部分的端粒结构，影响到与端粒相邻的一些重要基因 科学家们考虑：可能存在着一种不同于DNA 聚合酶的酶来完成单链间隙的复制,酵母细胞,酵母细胞,酵母TS,四膜虫TS,1984,Shampay的加尾实验,1985，Greider、Blackburn的实验,孵育,四GT,pBR322,四CA,5,3,酵GT,1）端粒的加尾方向是按GT链从5端到3端。 2）每次加一个重复单位。 3）似为无模板复制。 4）被加尾
4、的末端序列具有特异性。 5）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有蛋白酶活性的物质。,实验推论：,含有RNA组分和蛋白质组分，两者均为酶活性所必需。对RNA酶极为敏感。,端粒酶自带模板的逆转录酶,159nt,端粒酶蛋白质,1995年，Collins K等首次从四膜虫端粒酶提取出蛋白质组分：,p80,p95,端粒酶蛋白质,1996年，Lendray等在酵母中发现与端粒酶活性相关的Est2蛋白质； 1997年，Lingner等在纤毛虫中发现P123与P45等端粒酶亚单位； 1997年，Nakamura等与Mergerson等分别从各自实验室获得了人的端粒酶亚单位，命名为hEst2或hTRT（human
5、 telomere reverse transcriptase)； 1997年，Hrrington与Nakayama等发现人端粒酶协同蛋白TP1/TLP1,非模板区：酶和底物的结合位点,模板区：特异性,端粒酶全酶,RNA,蛋白,端粒酶相关蛋白,端粒逆转录酶,端粒逆转录酶,是端粒复制所必须的一种特殊的DNA聚合酶 具有逆转录酶活性 能以TR为模板，向染色体末端添加端粒序列，例TTAGGG,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,2.聚合,1. 结合,3.移位,爬行模式,端粒酶的功能,TTGGGG,TTGGGG,
6、末端补齐机制：,5,GGGGTT,（GGGGTT）n,端粒酶,5,G-G配对回折,3,5,DNA聚合酶,人端粒酶,89年从Hela细胞中发现 一种核糖蛋白酶，有三个主要组成部分 人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR） 人端粒酶相关蛋白（telomerase-associated protein，TP1/TLP1） 人端粒酶催化蛋白亚单位（the catalytic protein subunit of telomerase，hTERT）,正常人体细胞缺乏端粒酶活性。,与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比,人体细胞具有很长的端粒。,人的胚胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性
7、。,人的端粒与端粒酶,端粒与衰老,1973年， Olounikou博士，首次提出： “末端复制问题”与细胞分裂终止相关联,1981年 C.B.Harley证实：,细胞在培养过程中的确丢失了部分端粒，每次丢失 50-200bp,人体细胞的端粒长度每年缩短1050bp,Hutchinson-Gilford Progeria（早衰症）病人的细胞： 端粒的长度下降更快或显得更短,1990，Harley报告端粒长度与衰老的联系,端粒丢失与衰老关系,端粒丢失是衰老的原因？还是结果？ 目前的研究结果还处在探索阶段，各种关于端粒/端粒酶参与细胞增殖与转化的证据大多比较粗浅，而且，尚未被证实,衰老的机理,20世
8、纪初，大肠中毒学说 1958、59年，体细胞突变学说 1961、63年，差错灾难学说 1956，自由基学说 1979，基因程控学说 1990，端粒学说 交联学说，长寿、衰老基因学说，等,端粒酶与癌症,1994年，Counter等发现： 人腹水转移卵巢癌细胞：呈现端粒酶活性 正常卵巢上皮细胞：检测不到端粒酶活性 统计资料表明： 84.8%的恶性肿瘤具有活化状态的端粒酶， 仅在4.2%的正常组织、癌旁组织和良性肿瘤中端粒酶呈阳性 提示：端粒酶活性的变化与细胞恶化有关,端粒酶活性升高 可能引起癌症,对癌细胞的研究发现： 永生化是癌细胞所具有的显著行为 端粒酶被激活的细胞也具有永生化行为 癌细胞具有端
9、粒酶被激活的细胞所具备的特性 抑制端粒酶活性，使永生化细胞转变为正常细胞 癌细胞通过分泌大量端粒酶来防止染色体端粒缩短，以便不断分裂繁殖,端粒酶抑制剂的研究,1） 端粒酶靶点的优势 A 特异性：,B 广谱性：存在于各类恶性肿瘤细胞中 85%以上的恶性细胞中TREP（+）,正常细胞,癌细胞,抗癌策略,反义核酸,突变RNA的引入,端粒酶蛋白抑制剂,端粒酶生物学抑制剂,阻断端粒酶RNA的模板作用,端粒酶是以其自身RNA为模板来合成端粒DNA序列，因此可以通过消除其模板作用抑制端粒酶活性，达到限制端粒合成的目的 消除端粒自身模板作用的方法 反义核苷酸封闭hTR 反义肽核酸封闭hTR 锤头状核酶切割hT
10、R序列,反义核苷酸封闭hTR,端粒酶 RNA序列中含有与端粒DNA互补的模板序列，因此可设计能与之结合的反义核苷酸来灭活端粒酶，从而阻止端粒序列的合成 Feng等首先用含反义hTR的质粒转染HeLa细胞,经过2326倍增时间后，HeLa 细胞进入生长危机，并伴随端粒长度的缩短和端粒酶活性的抑制,反义核苷酸封闭hTR,为了提高抗核酸酶降解和进入组织细胞的能力， Piytts 等设计了一种甲基化的反义 RNA（ 2-O-methyl-RNA ），用阳性脂质将其导入人前列腺肿瘤细胞系DU145，使细胞的端粒酶活性减少了97% 有学者发现，用硫代反义核苷酸活性，还能抑制淋巴瘤细胞系OMABL1的生长，
11、诱导细胞凋亡,反义肽核酸封闭hTR,肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一类人工合成的DNA或RNA类似分子 PNA与核酸分子的不同之处在于：将DNA中的磷酸脱氧核糖骨架被酰胺键连接的多肽骨架所代替，碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸的氨基连接 PNA具有与天然DNA相类似的结构特征和相同的DNA/RNA结合特性,PNA与DNA结构比较,骨架由 N-（ 2-氨基乙基）甘氨酸构成 碱基通过亚甲基羰基与骨架中甘氨酸的氨基连接,反义肽核酸封闭hTR,PNA不带电荷，中性骨架间无排斥力，使之具有比DNA寡核苷酸更强的结合力和抗蛋白酶和核酸酶降解能力 Norton等，设计了针对hTR模板区的不同长度的PNA，发现其对端粒酶活性的抑制在一定长度范围内随链的延长而增强 PNA的高度亲和性、高度特异性和抗降解能力，使之成为极具潜力的抗肿瘤新药,衰老端粒/端粒酶 癌症,衰老可能是由端粒的缩短所致， 激活端粒酶似乎可以阻止衰老 可是，端粒酶一旦被重新激活，细胞又将成为永生化细胞，继而衍变为癌细胞 如何能恰当、正确的发挥端粒/端粒酶在解决衰老与癌症中的作用？ 生命科学领域一个极具挑战性的课题,
