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1、染色体显带原理与技术,肖文珺 首都医科大学附属世纪坛医院检验科 细胞分子遗传专业组,一、染色体制备基础知识,（一）细胞及细胞周期 （二）从DNA到染色体,（一）细胞周期及有丝分裂,细胞：生物体结构和功能的基本单位，也是生命活动的基本单位。图略。 细胞周期：指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程。,G1期，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间； S期，指DNA复制的时期； G2期，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； M期，细胞分裂开始到结束。 G0期：间期细胞，细胞周期之外的细胞。,有丝分裂,（二 ）从DNA到染色体,DNA,螺线管,超螺线管,染色单体,核小体,压缩
2、7倍,压缩40倍,压缩6倍,压缩5倍,共计压缩8400倍,核小体 nucleosome：染色质的基本结构,DNA分子的不同存在形式：染色质和染色体,染色质：间期细胞核中遗传物质的存在形式。 染色体：分裂中期遗传物质的存在形式。一条染色体是一个DNA分子。,染色质：根据在分裂期和间期的染色不同，分为,常染色质：在间期核中分布较稀疏，浅染色，是转录活跃的DNA部分，一般位于核中央。在分裂期，位于染色体臂，深染色。含大量功能基因。 异染色质：是呈凝集状态的DNA与组蛋白的复合物，由于螺旋化程度高，又称为浓缩染色质，一般位于核内膜的边缘形成一薄圈，即称周围染色质。主要位于位于染色体的着丝粒、次缢痕、端
3、粒等位置。间期和分裂期都深染色。基本无功能基因。,基本概念,在细胞周期的有丝分裂中期，染色体的形态结构比较稳定，一般所描述的染色体的形态结构都是中期染色体。 染色体组型：又称核型Karyotype，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。 核型模式图Idiogram：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。,二、染色体显带技术,Q带：喹丫因染色后，紫外照射下的明暗带（富含AT的明带，富含GC的暗带）； G带：Giemsa染料染色后所呈现的染色体区带；（AT区是深色
4、） R带：是中期染色体经碱性磷酸盐处理，丫啶橙或Giemsa染色后所呈现的带型，一般与G带正好相反； C带：显示着丝粒结构异染色质及其它染色体区段的异染色质。 T带：是染色体端粒部位经丫啶橙染色后呈现的区带； N带：Ag-As染色，主要染核仁组织者区域的酸性蛋白。 1975年建立了染色体高分辨显带技术。,几种显带的制作方法之间的关系,G显带实验原理基础G显带：制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹带，表明每条染色体的特征。,只有可以分裂的活细胞，才能制备染色体。实验材料：人外周血淋巴细胞，植物血凝素（PHA）刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母
5、细胞，使其恢复增殖能力。 使用秋水仙素或者秋水仙碱破坏纺锤丝的形成，将细胞阻留在有丝分裂中期。从而获得大量的细胞中期分裂相供染色体分析。-采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞。 细胞低渗技术使细胞中的染色体在玻片上铺散得更好，易于计数和观察。 甲醇/冰醋酸固定液快速杀死和固定细胞。,染色体检查过程（G显带）,培养细胞； 秋水仙素处理；抑制中期分裂相 低渗；使细胞膨胀 固定；染色体形态固定 滴片；分散染色体。冰片法，熏蒸法。 显带和染色； 显微镜下分析。,实验步骤 1. 采血及接种培养 1.1
6、 采血：灭菌注射器抽取外周静脉血35ml(绿帽肝素抗凝管） 1.2 接种 在超净工作台中，注射器滴加25滴全血（6号针头）至外周血淋巴细胞培养液中（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清），水平摇动混匀。置37恒温培养箱中培养6872小时。 1.3 终止培养前3540min，加入秋水仙素，使终浓度达到0.5g/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养。 秋水仙素主要作用在于能阻滞微管(纺锤丝)形成，或使已形成的微管 解聚，从而使染色体停留在中期。 秋水仙素浓度大，则处理时间短，如浓度小，则处理时间长。但若秋水仙素加入过量，或处理时间过长，分裂细胞多，染色体凝集和收缩变小，或发
7、生异常分裂现象，甚至染色体破碎，不宜用于观察染色体的形态及计数；秋水仙素加入太少，或处理时间偏短，染色体形态偏长或无中期分裂相。,2制片 2.1收集细胞：将全部培养物吸入刻度离心管中，2000 rpm离心5分钟 2.2 低渗：弃上清液，加入37预温的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37恒温水浴箱低渗处理2025分钟。 2.3预固定：加入 1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1）或清质剂300ul，用吸管小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。 2.5 固定： 第一次：弃上清液，加入3ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定15分钟， 2
8、000rpm离心5分钟。 第二次：弃上清液，重复固定一次。 第三次： 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。 2.6 滴片： 吸取少量细胞悬液，滴23滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，水蒸气熏蒸，70 2小时烤片，待染色。,3.G显带 3.1 取2.5胰酶溶液0.5ml，加入50 ml生理盐水染色缸中（终浓度0.025%），用 1N HCl或1N NaOH调节PH7.0左右，置 37OC预温。 3.2 将烤好的玻片标本放入胰酶溶液中处理60秒钟左右（胰酶消化时间需不断调试，摸索。不同时间配制，不同批号胰酶，以及随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间都
9、会变化） 3.3 取出染色体玻片标本，置于37预温的生理盐水中，终止胰酶的作用。 3.4 将玻片标本放入37预温的1：10稀释的Giemsa染液中，染色510分钟。 3.5 自来水冲洗，自然晾干。,G显带常见问题及处理：,培养细胞: 细菌污染。霉菌污染。细胞收获量小。玻片上细胞间期核稀疏。 秋水仙素：大量染色体太细长，缠成毛线团样。分裂相很多，但染色体短小，分叉。 几乎没有分裂相。 低渗：太分散。不分散。 固定：太发毛。背景不干净。有大团块深染色物质。 滴片；不分散。太分散。 显带和染色；没有条带。条带模糊。一个分裂相内，有的染色体有条带，有的没有。有的胰蛋白酶消化太过，有的分裂相则不足。Gi
10、emsa染不上色。染色太深。染色太浅。,各种组织标本的染色体制作,不同的标本，不同的检查目的，需要调整染色体的制作过程。处理原则：使尽可能多的细胞进入细胞周期，旺盛生长，大量分裂，防止污染。,外周血：5%小牛血清RPMI-1640，+PHA。检查体细胞核型。 骨髓：10 %小牛血清RPMI-1640，不含PHA。检查肿瘤细胞核型。 羊水：标本珍贵。专用羊水培养基，防止母体细胞污染。检查胎儿细胞核型。 绒毛组织：同上。细胞为细胞团（组织），防止细菌污染。清洗、剪碎后消化成单细胞或者细胞团培养。检查胎儿核型。 脐带血：血液细胞，性质同外周血。一定注意防止母体污染！检查胎儿核型。 活检组织：如实体瘤
11、标本。 细胞系：永生细胞。直接常规制作染色体标本即可。,C显带,将染色体用碱或者去垢剂处理后，再用 Giemsa 染色，可以得到只显示着丝粒区域的 带纹，称为 C带。,实验原理,C显带技术由Arrighi和Hsu于1971年发明，是显带技术中最简单的一种带型。其方法的本身是起源于原位杂交。Arrighi和Hsu发现用碱处理载玻片上的染色体使DNA变性之后，再在SSC溶液中、65的条件下使其复性，在受控制的条件下经Giemsa染色可显示出在染色体的一定部位是深染的。70年代用原位杂交的方法证明深染的区域（C带区）是结构异染色质的区域，也就是一般而言的DNA高度重复序列的区域。然而，现在更为流行的
12、看法认为氢氧化钡或其它碱性物质的处理是优先提取了非C带区的DNA，SSC的处理有助于带型的清晰。,实验用品,光学显微镜，恒温水浴箱，培养皿，小镊 子，未染色的染色体标本片（片龄一周内）， 5%氢氧化钡水溶液，2SSC液，0.2mol/L HCl，PBS，吉姆萨染液。,实验方法,1、制片：常规外周血法制备的标本。 2、HCl处理：取5-7天标本龄的染色体标本， 选择染色体分散好的标本在0.2mol/L HCl中室温下处理10分钟-1小时，然后用自来（蒸馏）水冲洗干净。这一处理是使DNA脱嘌呤，但没有DNA骨架的断裂。（此步也可省略） 3、氢氧化钡处理：将标本浸入60-65的5%（饱和）氢氧化钡液
13、中，10秒至几分钟（随标本龄而变动，常规：1-4分钟；1月龄片：8-16分钟，最好设置梯度），碱性处理可能通过产生一个高水平的DNA变性，促进DNA溶解。,4、 2SSC处理：在60-65的2SSC液中处理90分钟时，用自来水冲洗干净，2SSC温育可使DNA骨架断裂并使断片溶解。 5、 染色：用蒸馏水配制5%Giemsa，染色5-10分钟，用自来水冲洗干净，室温下风干后即可镜检。 6、 镜检：用显微镜高倍镜镜下检查显带标本，如着丝粒区域或异染色质部位（1,9,16号染色体次缢痕）及Y染色体长臂q12深染，染色体其它部位染色浅，即为可取标本。若观察到染色体均呈白色，那么，可能是碱处理或2SSC温
14、育过度。,显带观察,严格地讲，C带显示的是紧邻着丝粒的异染色质区。可见，在人体染色体C带标本中，深染的有：1、绝大多数染色体的着丝粒区；2、第1，9和16号染色体的次缢痕；3、Y染色体长臂的远侧端。,巴黎会议（1971）对各条染色体的C带描述如下: 1号 大，从着丝粒扩展到q。 2号 小。 3-8号 中等 9号 大，从着丝粒扩展到q。 10号 中等。 11号 中等，但比10号或12号大些。 12号 中等。 13号 中等，有时分为二节。 14号-15号 中等。 16号大，从着丝粒向q扩展。,17号 中等。 18号 中等，但比17号大些。 19-22号 中等。 X 中等 Y在着丝粒处有一条非常窄的
15、带；q的末端有一宽带。1，9，16号的C带和Yq上的宽阔的远侧带都有明显的形态变异及异态性。,R显带,原理： 在细胞的培养过程中加入碱基的类似物，然后用紫外线照射后再用 Giemsa 染料染色，可以得到和 G显带相反的带纹，称为 R带。 即G显带的深带变为浅带，浅带染成深带。当G显带显示的染色体两臂末端为浅带时，如果两臂末端发生缺失等异常，一般难以发现和识别，而R带正好能将此处显示出易于识别的深带。所以，R显带技术有利于检测染色体的末端缺失、重排等。,光学显微镜、恒温水浴箱、紫外灯、培养皿、 常规制片材料、BrdU、秋水仙素、2SSC溶 液（0.3mol/L NaCl+0.03mol/L柠檬酸
16、钠）、 Gimesa染液等。,实验用品,实验方法,1.常规培养细胞，终止前10小时在培养基中加BrdU（使其终浓度为12g/ml）。 2.继续培养6小时后加秋水仙素20g/ml的3滴（7号针头垂直竖滴，使终浓度为0.04-0.08g/ml）。 3.常规收获、处理细胞，制片。 4.在60恒温水浴箱中，置一培养皿于水面上（皿内加1/3 2SSC溶液，将所制玻片浸泡在内）。距玻片10cm处放置一20瓦紫外灯，照射玻片30-45分钟。 5.待紫外处理时间结束后，用自来水冲净。 6.Gimesa染色5分钟，自来水冲净，室温干燥后于镜下观察。,注意： 1. Brdu的浓度和作用时间是实验成败的关键。 2.紫外灯照射距离玻片太远也不利于带型的显示。 3. 若为女性标本，还可见淡染的迟复制X 。,显带观察,各号染色体显现的带纹与G显带相反，在G带染色体标本出现的深带用R显带法就是浅带，同时在G显带染色体标本出现的浅带用R显带法就是深带。与G显带的对比图：,R显带总体图,G11技术,G11式显带是一种特异性显示9号染色体 次缢痕的显带方法，一般用
