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1、分子生物学实验实验报告实验名称： 蛋白印迹技术 姓 名： 陈 杰 学 号： 3140104666 序 号： 25 同组同学： 唐陈曦 带教教师： 刘伟 俞萍 实验日期： 2015年9月29日 目录1.原理31.1 Westen印迹技术31.2 RT-PCR41.3 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）52.操作步骤52.1 安装垂直板型电泳装置52.2 凝胶的制备52.3 转膜62.4 封闭62.5 一抗反应62.6 洗涤72.7 二抗反应72.8 洗膜72.9 检测73.实验结果83.1 照片记录83.2 数据处理84.讨论101.原理1.1 Westen印迹技术蛋白质印迹技术又称免疫印
2、迹技术和Western印迹技术(Western blotting)，是鉴别蛋白质的分子杂交技术。Western blotting的原理是将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。且能保持电泳分离的蛋白质的相对位置不变（转膜装置和预染的标准相对分子质量蛋白的转膜结果见图8-2-55-2-7）。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应，经过底物显色、化学发光或放射自显影，可以检测电泳分离的某种特定蛋白成分的存在和含量。该技术也广泛应用于检测某种蛋白的表达
3、水平。Western blotting实验过程主要有以下几个步骤：1、SDS-PAGE分离待检测的蛋白质；2、转膜：将SDS-PAGE分离的蛋白质转移到膜上；3、封闭：即利用非反应活性物质封闭固相载体膜上未吸附结合蛋白质的区域；4、抗体结合：即利用相应蛋白质的抗体（一抗）与待测蛋白质进行免疫结合，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应；5、底物显色或放射自显影检测电泳分离的特异性目的蛋白的存在与否和含量。Western blotting的转膜方式以电转移最为常用，固相载体主要有：硝酸纤维素薄膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。硝酸纤维素薄膜结合蛋白的能力为100ugcm2，综合性能较好，以往
4、使用的人较多；尼龙膜结合蛋白质的能力较强(480ug/cm2)，有很高的灵敏度，但结合背景较高；PVDF-膜具有较好的结合蛋白质的能力（200ug/cm2），且能较牢固地结合蛋白质，该膜的机械性能和化学特性强，不易卷曲或撕裂，在90%甲醇的脱色条件下也不会影响膜的结构，结合在膜上的蛋门质可以直接进行序列分析，具有较好的染色和检测的兼容性。常用的二抗标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，辣根过氧化物酶最敏感的底物是3，3-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位被反应转变成棕色沉淀。在钴或镍离子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排
5、除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反应，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反应。碱性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-引哚磷酸氮蓝四唑(BCIP/NBT)在原位转变为深蓝色化合物。这是利用二抗标记物进行的显色反应是最早的Western blotting检测方法，现在主要用于免疫组化，在显微镜下观察。该方法的灵敏度相对较低，可以检测ng水平的目标蛋白。ECL化学发光检测试剂是基于Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶(HRP)催化发生化学反应，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现，或使用Luminometer检测。溶液A主要成分为Lumin
6、ol及特制发光增强剂，溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。发光液A和B在HRP的催化作用下Luminol与H2O2反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在激发过程中不需要消耗HRP，HRP只是起催化作用，所以只要HRP没有降解失活，是可以重复加发光液进行观察的。ECL化学发光检测灵敏度高，可以检测pg水平的目标蛋白。抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂Western blotting 示意图1.2 RT-PCRRT-PCR是一种在转录水平上检测基因的方法。首先提取组织或细胞中的总RNA，然后以RNA（主要是mR
7、NA）为模板，以与RNA 3端互补的引物或Oligo-dT在逆转录酶的作用下进行逆转录，生成cDNA的第一条链。然后以cDNA 3端互补的引物以及与RNA 3端互补的引物组成引物对进行PCR扩增，最后通过电泳来检测是否产生PCR的扩增区带，判别目的基因是否表达。为了避免由于RNA的降解而导致阴性的实验结果，在进行RT-PCR时要设立一个内参照（管家基因的表达），以避免出现假阴性结果。同时内参照可以对基因表达的变化起到半定量的作用。RT-PCR技术灵敏性高，常用于检测细胞中是否表达了某种RNA，是基因表达检测的方法之一。1.3 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）利用蛋白质的等电点和分子量的
8、差异，通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质分离开。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的双重优点。第一向电泳是等电聚焦，在细管中进行，蛋白质根据其等电点不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行第二向电泳。在第二向电泳过程中，蛋白质依据其分子量大小进行分离。由于双向电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白 。2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术，是蛋白质组研究中最早的支撑技术之一。在2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离。接着被转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据
9、相对分子质量大小不同被分离。用适当的染色技术显示被分离的蛋白。2.操作步骤2.1 安装垂直板型电泳装置将玻璃板用蒸馏水洗净晾干。把玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。2.2 凝胶的制备1. 分离胶的制备：在一个干净的小烧杯中，按下表所列的试剂用量配置。根据室温来调节TEMED的加入量。 12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶配制用量表30%stock acrylamide（凝胶贮液）4.0mL3mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8（分离胶缓冲液）1.25mL10% SDS0.1mLddH2O4.0mL10% Ammonium persulfate0
10、.07mL2% TEMED0.6mL将所配置的凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面用1000uL取液枪加至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘约1cm。沿玻璃片内壁加一层异丙醇（用于隔绝空气，使胶面平整）。凝胶配置过程要迅速，加速剂TEMED要在注胶前再加入，否则会提前凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。2. 浓缩胶的制备：在另一干净的小烧杯中，按表配置浓缩胶，应根据室温来调节TEMED的加入量。混匀后用细长头的滴管或1000uL取液枪将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至加满，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子”的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）
11、。约30 min后凝胶聚合，再放置30min。小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。4.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶配制用量表30%stock acrylamide（凝胶贮液）0.75mL3mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8（分离胶缓冲液）0.83mL10% SDS0.1mLddH2O3.0mL10% Ammonium persulfate0.05mL2% TEMED0.3mL2.3 转膜戴上手套，取下电泳好的凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下，立即放在3张转膜缓冲液浸湿的Whatman 3MM滤纸上，将电泳完毕的凝胶放放在滤纸上面。盖上1张经甲醛激活的PVD
12、F膜（用刀片切除多余的滤纸和滤膜，使其大小均与凝胶完全吻合）排除气泡后，盖上另3张同样处理的滤纸，排除气泡。按照顺序：负极3层滤纸-凝胶-膜-3层滤纸-正极。用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置，将电泳槽搁置冰上。90V电压1h。取下膜放入培养皿中加入立春红预染1min初步观察转膜结果TBST淋洗保存。(转膜后的PVDF膜晾干后可在4冰箱中保存1周。）2.4 封闭电泳结束后取下PVDF膜，用TBST淋洗后加入封闭液，室温摇床轻摇1-3h，2.5 一抗反应取出PVDF膜，用TBST淋洗，放入含1：10000稀释的一抗溶液中（用TBST稀释）室温至少1h或者4过夜。2.6 洗涤回收一抗放置4保存（必要时
13、加入叠氮钠防霉）用lTBST漂洗PVDF膜3次，每次10min2.7 二抗反应PVDF膜放入1：3000倍稀释的HRP标记的第二抗体溶液中（用TBST稀释），置温室摇床1h。2.8 洗膜1TBST洗涤3次，每次10min2.9 检测将PVDF膜上加ECL化学发光液（A、B准备0.5mL等量混合，可直接加在PVDF膜上），反应5min后在化学发光检测仪上观察并记录实验结果。3.实验结果3.1 照片记录3.2数据处理最后加ECL化学发光液（这一步是老师操作，为节约时间三组一起进行），其中第一组是我们组的可以观察到我们组（25号 26号）的二号框中，左侧部分约为右侧部分粗细的1.5倍，与浓度比1.5
14、：1相符合。4.讨论根据实验结果，可以看到一号框与二号框内总体结果较好，条带粗细的比例与加样浓度比例相符，其中三号框（别的组的条带）几乎没有条带，分析应该有这几种可能性：1、一抗和二抗失效；2、一抗与二抗不匹配；3、ECL液失效；4、抗体染色不充分；5、被测样品中不含有目的蛋白质或者目的蛋白质含量太低；6、溶液中有二抗标记物的抑制剂；7、抗体活力降低；8、转膜时未充分接触。由于实验的材料三号框他们组和我们组所用材料是一样的，所以排除了可能性1、2、3，又由于在实验二（本次是实验三）中他们组没有出问题，所以排除了可能性5，则根据具体情况，我想可能性7和8的概率更大，应该是抗体拿出来之后离开冰浴时
15、间太久。可以更换抗体重新再做一次，判断实验结果。或者直接不变条件重新操作，看是否是因为转膜的问题。而四号框的情况，明显有气泡，另外就是条带特别粗，又连在了一起，我想可能是加样量很多或者是发光液加的过多。可是试一试用PBST洗膜20min，期间换2次液。再看是否变正常一点。而为了避免有气泡，玻璃板一定要洗干净，用酒精洗干净之后再用双蒸水冲，再晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。同时配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。特别是枪打到底的时候非常容易产生气泡。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸
