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1、学 海 无 涯,科研课题申请书,1,课题项目:,申请人:,学号:,单位: 专业,申请时间:,2014年12月,细胞粘附分子 T-cadherin（T-cad）基因在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种 肿瘤中因启动子甲基化而失活，其表达显著下降或缺失，推测其可能 为一新的肿瘤抑制基因。申请人首次证实 T-cad 基因在脑胶质母细 胞瘤 C6 细胞中的肿瘤抑制基因功能，并揭示其分子机制。本研究 将在肝癌细胞株进一步研究 T-cad 基因失活与肝癌细胞的增殖及侵 袭等恶性生物学特征的关系，并调查其分子机制；在临床切除的肝癌 标本中研究 T-cad 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶 性生物学特征的关系
2、，明确 T-cad 基因失活与临床肝癌预后的关系； 在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化药物是否能重新诱导 T-cad 分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探 索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的 分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水 平具有重要意义。,2,学 海 无 涯 关 键 词：T-cadherin；肿瘤抑制基因；肝癌 （一）立项依据与研究内容 1、项目的立项依据 原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数 病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第 二位。研究已表明肝癌的发生乙肝、丙
3、肝感染及摄入黄曲霉素污染的 食物有密切关系, 其发生发展与多种癌基因过度表达，以及肿瘤抑制 基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清 楚。因此, 进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶 性特征的关系，对揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗 药物及判断预后， 进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。 T-cadherin 分子属细胞粘附分子 cadherin 超家族。 Cadherin 超家族 分子为细胞表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细 胞极性及形态形成，以及参与细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。 经典的 Cadherin
4、分子如 E-cadherin 和 N-cadherin 由细胞外钙结合 区及跨膜区两部分组成，而 T-cadherin 因缺失经典Cadherin 分子所 具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命 名truncated-cadherin（即 T-cadherin，又称 CDH13 或 H-cadherin）。 近年来对经典的 Cadherin 分子的深入研究发现，E-，N-cadherin 分 子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移 特征密切相关（6，7，8,9,10）。将 E-cadherin 分子重新导入缺失 E-cadherin 分子表达的肿瘤
5、细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著,3,学 海 无 涯 受抑（11）。近年已开始有 T-cadherin 分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、 结直肠癌、卵巢癌及皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12，13， 14，15,16,17,18），推测 T-cadherin 分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤 抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制 进行研究。2003 年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将 T-cadherin 基因导入缺失表达 T-cadherin 分子的大鼠脑胶质母细胞瘤 C6 细胞 使其过度表达 T-cadherin 分子，C6 细胞的增殖及侵袭能力显著受抑， 首次证
6、实 T-cadherin 在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功 能， 并进一步揭示其抑制机制是 T-cadherin 分子通过诱导 P21 CIP1/WAF1 表达致使肿瘤细胞于细胞周期 G2 期阻滞。该文发表于 Molecularand Cellular Biology 2003,23:566-578（19）。这一研究发现为 进一步研究 T-cadherin 分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠 定了坚实的基础。肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的 发病机制中起着重要作用（20，21，22，23）。T-cadherin 基因在乳 腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于其
7、启动子异常甲 基化导致 T-cadherin 基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降 或缺失（13,16,24）。T-cadherin 基因位于染色体 16q24，肝癌的发生 与染色体 16q24 的缺失、突变密切相关(25)。 Riou （2002）对位于 染色体 16q24 的 13 个常常在肝癌中缺失表达 的 基 因 的 转 录 研 究 发 现 ， T-cadherin mRNA 在 HepG2, PLC/PRF/C,TONG 和 HA22TNGH 四种肝癌细胞株中缺失表达，但 T-cadherin 基因本身并未发生缺失突变（12）。Yu（2002）,4,学 海 无 涯 进一步研究显示
8、 T-cadherin 基因启动子在肝癌中高度甲基化，而 E-cadherin 基因启动子在肝癌中不发生甲基化，表明在 Cadherin 细 胞粘附分子超家族中 T-cadherin 基因启动子 甲基化在肝癌中具有高度特异性,且 T-cadherin 基因启动子甲基化与 T-cadherin 基因失活密切相关（26）。这些研究表明 T-cadherin 基因 启动子甲基化是 T-cadherin 基因在肝癌中失活的主要机制。Takeuchi 在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与 2ug/ml 去甲基化药 物 5-aza-2 -deoxycytidine 共孵 6 天能使皮肤鳞癌细胞株恢复 T-c
9、adherin 分子表达（17）。 但目前对 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复 发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导 T-cadherin 分子在肝癌细胞株中重新表达， 并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报 道。本研究将进一步研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能，调查缺 失表达 T-cadherin 的肝癌细胞株重新表达 T-cadherin 是否能抑制肝 癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，并在裸鼠肝癌模型上 加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临床切除的 肝癌标本中研究 T-cadheri
10、n 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及 复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示 T-cadherin 基因失活与 临床肝癌预后的关系。在肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲 基化药物能重新诱导 T-cadherin 分子表达，并抑制肝癌细胞的增殖、 侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副,5,学 海 无 涯 作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究 T-cadherin 基 因与 C6 细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预 期该研究成果能达国际先进水平。 主要参考文献： Angst BD, Marcozzi C and Magee AI. The
11、cadherin superfamily: diversity in form andfunction. J Cell Sci., 2001, 114:629-641 Kemler R. Classic cadherins. Semin. Cell Biol., 1992,3:149-155 Koller E, Ransch B. Differential targeting of T- and N-cadherin in polarized epithelial cells.J Biol Chem.,1996,271:30061-30067 Takeichi M.Cadherin cell
12、adhesion receptor as a morphogenetic regulator. Science1991,251:1451-1455 Angst, B.D., Marcozzi, c., and Magee, A.L. The T-cadherinsuperfamily: diversity in fromand function. J.Cell Sci 2001, 114:629-641 Berx, G., and. Van Roy, F. The E-cadherin/catenin complex: an important gatekeeper inbreast canc
13、er tumorigenesis and malignant progression. Breast Cancer Res. 2001,3:289-293. Bremnes, R. M., Veve R., Gabrielson, E. et al. High-throughput tissue microarray analysis used to evaluate biology and prognostic significance of the E-cadherin pathway in non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 2002,
14、20: 2417-2428. Handschuh, G., Candidus S., Luber B., et al. Tumour-associated E-cadherin mutations alter cellular morphology, decrease cellular,expression in human non-small cell lung cancer is associated with,6,学 海 无 涯 adhesion and increase cellular motility. Oncogene 1999, 18:4301-4312. Levenberg,
15、 S., Yarden A., Kam Z., et al. p27 is involved in N-cadherin-mediated contact inhibition of cell growth and S-phase entry. Oncogene 1999,18: 869-876. Altered expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma : correlation with genetic alteration, beta-catenin expression, and clinical features. He
16、patology 2002,36:692-701 Vleminckx, K., Vakaet L., Mareel Jr. M., et al. Genetic manipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppressor role. Cell 1991,66:107-119. Riou P, Saffroy R, Comoy J, et al. Investigation in liver tissues and cell lines of the transcription of 13 genes mapping to the 16q24 region that are frequently deleted in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res. 2002 Oct;8(10):3178-86. Sato, M., Mori, Y., Sakurada, A., et al. The H-cadhe
