艾德KRAS试剂盒说明书

上传人:l**** 文档编号:145338683 上传时间:2020-09-19 格式:DOC 页数:7 大小:42.50KB
返回 下载 相关 举报
艾德KRAS试剂盒说明书_第1页
第1页 / 共7页
艾德KRAS试剂盒说明书_第2页
第2页 / 共7页
艾德KRAS试剂盒说明书_第3页
第3页 / 共7页
艾德KRAS试剂盒说明书_第4页
第4页 / 共7页
艾德KRAS试剂盒说明书_第5页
第5页 / 共7页
点击查看更多>>
资源描述

《艾德KRAS试剂盒说明书》由会员分享,可在线阅读,更多相关《艾德KRAS试剂盒说明书(7页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。

1、. . . 【产品名称】通用名称:人类KRAS基因7种突变检测试剂盒(荧光PCR法)英文名称:Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase ChainReaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤,在肺癌患者中的突变率为1530%,在结直肠癌患者中的突变率为2050%。导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。KRAS基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药,使结直肠癌患者对抗EGFR

2、抗体类药物产生耐药。但是,2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp(G13D)突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性(参见:De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820)。因此,KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性,降低治疗费用,节省宝贵的治疗时间。大部分肿瘤的突变都是体细胞突变,突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起,因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA,所以对体细胞突变检测需要较高的特异性,而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限,不能完全满足临床需要。本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突

3、变(见表1),试剂盒以DNA为检测样本,提供突变状态的定性评估。辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测,为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变 突变名称 氨基酸变化 碱基变化 Cosmic ID 公司命名 Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸 GGTGAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸 GGTGCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸 GGTGTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到

4、丝氨酸 GGTAGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸 GGTCGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸 GGTTGT 516 12-1-T Gly13Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGCGAC 53213-2-A【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术,检测DNA样品中含有的突变基因。利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大,与此同时,利用双环探针对扩增产物进行检测,结合特别的PCR反应程序和高特异Taq酶的使用,在实时PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测,以达到对稀有突变检测的高特异性和高灵敏度,即高的选择能力。

5、【主要组成成份】试剂盒采用8联PCR管设计,每一个8联PCR管检测一个样品,8联管的1-7(或A-G,或8联PCR管两端各有一个小孔,小孔居侧端为1号管,小孔居中端为8号管)管装有相应的KRAS基因7种突变检测和控试剂,突变由FAM信号指示,控由HEX(或VIC)信号指示;8(或H)号管作为DNA提取质量的外控检测管,亦由FAM信号指示,控和外控作为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控,选择的检测区域是人类KRAS基因相对保守的区段,约100bp,这样即便DNA有降解,外控和控仍然能够最真实地反检测所用DNA的质量非常重要。由于肿瘤的复杂性,所采集的临床样品应KRAS基因有效的DNA量。每个P

6、CR反应管均含有510 pM特异性引往往会混有正常组织细胞,不同类型样品正常细胞混杂程度不同,而且提取的物、20 pM双环探针、12.5 M dNTPs、175 M氯化镁、1 mM硫酸铵、2.5 mMDNA纯度和质量也因样品类型而改变,尤其是用福尔马林固定的石蜡切片样氯化钾和纯化水等。(详见表2和表3)品,福尔马林会对DNA有交联和降解作用,因此请按下面推荐样品类型顺序表2 试剂盒组成收集样品并提取DNA用于检测,客户可根据临床实际样品的情况进行选择。试剂盒规格 12测试 1. 推荐样品类型顺序:新鲜病变组织冰冻病理切片石蜡包埋病理组织或切8联PCR管反应条 12条 片。Taq酶(KRAS)

7、35 L 2. 推荐使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA。所提DNA需用紫外分光KRAS阳性质控品250 L光度计测定浓度,其DNA的OD260/OD280在1.82.0。提取完的DNA建议立表3 8联PCR管反应条的组成即进行检测,否则请于-20以下保存,保存时间不要超过6个月。 管号 检测试剂 体积 荧光信号 3. 从新鲜病变组织中取样应确定至少含有30%肿瘤病变组织。1 A 12-2-A 35 L FAM,HEX/VIC 2 B 12-2-C 35 L FAM,HEX/VIC 4. 石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞,所取部分尽量在3 C 12-2-T 35 L FAM

8、,HEX/VIC 蜡块中部。4 或 D 12-1-A 35 L FAM,HEX/VIC 5. 所用石蜡包埋病理组织或切片样品一般请选择保存尚未超过3年的样品。5 E 12-1-C 35 L FAM,HEX/VIC 【检验方法】6 F 12-1-T 35 L FAM,HEX/VIC 建议在每次PCR反应中,每份样品和阳性质控品(STD)、阴性对照(NTC,7 G 13-2-A 35 L FAM,HEX/VIC自备纯化水)共同进行分析。8 H外控35 LFAM 1. 取出KRAS阳性质控品和Taq酶(KRAS),阳性质控品先解冻,再振荡混匀。其它需要自备的试剂和耗材有:阳性质控品和Taq酶(KRA

9、S)需快速离心15秒待用。1. 石蜡切片样品DNA提取试剂推荐选用艾德生物公司的核酸提取试剂2. 分别向体积均为45 L的待测样品DNA、KRAS阳性质控品和纯化水(NTC)(型号:FFPE DNA,Cat NO. ADx-FF01);组织和胸水可使用艾德中加入2.25 L Taq酶(KRAS),涡旋器上混匀15秒,然后快速离心15秒。 生物公司的组织、胸水样品DNA分离试剂盒(Cat NO. ADx-TI01)。 (1) 根据样品来源不同,可将其分为石蜡切片样品和非石蜡切片样品。2. 无DNase和RNase移液器滤芯吸嘴。 新鲜病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。 3. 无DNa

10、se和RNase的纯化水。(2) 石蜡切片样品的DNA浓度推荐为1.53 ng/L,即每单个反应管添加【储存条件及有效期】的DNA量为7.515 ng。根据石蜡切片样品保存的年限不同,建议:须避光储藏在-205。有效期为10个月。开瓶后使用不影响产品有效保存不超过三个月的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度期。使用完毕后于-205保存。为1.5 ng/L;保存年限三个月至一年的石蜡切片样品每单个反应管试剂盒在运输过程中,需要泡沫箱加冰袋密封运输,运输时间不超过一周,添加的DNA浓度为2 ng/L;保存年限一年至三年的石蜡切片样品每运输温度不高于室温。单个反应管添加的DNA浓度为2.53 n

11、g/L;不推荐使用保存超过三【适用仪器】年的石蜡切片样品。Stratagene Mx3000P?/3005P?、ABI7900HT、ABI7500、ABI StepOnePlus、(3) 非石蜡切片样品的DNA浓度推荐为0.41 ng/L,即每单个反应管添ABI7300、LightCycler480、Bio-Rad CFX96。加的DNA量为25 ng。注意:(4) 稀释样品DNA时推荐使用TE(pH8.0)。稀释方法不推荐跨数量级 使用ABI仪器时探针模式设置,Reporter Dye:FAM、VIC;Quencher 稀释,即每次稀释倍数控制在10倍以;稀释时取样量体积不宜小Dye:TAM

12、RA;Passive Reference:NONE。于5L,以免稀释后终浓度与预算值有偏差。 在ABI7900中,本试剂盒仅适用于ABI7900普通机型(非FAST机型),3. 在PCR管冰架上,轻轻揭开8联PCR管反应条的条盖。如发现管盖侧有液反应程序模式为标准模式,反应体积选择40 L,且需要PCR 8联反应条辅助点,开盖前请先离心。器(BIOplastics 公司,Cat:7900RAN)。4. 将混好的DNA样品依次取5 L靠着PCR管上管壁加入8联PCR反应条中,然 适用于LightCycler480代仪器,若需在LightCycler480代仪器上使后小心盖上8联PCR管反应条管盖

13、。用,则必须进行荧光校正。若LightCycler480代仪器也出现荧光交叉现象,注意:加好样品的PCR反应条应立即上机实验;若因特殊原因不能及时上则也需要进行荧光校正,且需要PCR 8联反应条辅助器(BIOplastics 公司,机反应,应将PCR反应条置于冰水混合物上或4冰箱(温度恒定)保存,Cat:B-79480)。保存时间不宜超过12个小时。 在使用Stratagene Mx3000P?/3005P?仪器时若发现荧光净升信号5. 离心8联PCR管反应条。(dR)较低且本底荧光(R)非常高,应适当降低仪器的增益设置。6. 将8联PCR管反应条放入实时PCR仪器。PCR反应板布局见表4中推

14、荐方法。 有关各仪器的具体设置方法可从艾德生物医药科技股份资料下载区获得。 PCR仪器在使用过程中应至少每年校准一次。【样本要求】1 / 2表4 PCR仪96 孔板建议布局名 称 1 2 ? 10 11 12 12-2-A 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-2-C 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-2-T 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-1-A 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-1-C 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 12-1-T 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 13-2-A 样品1 样品2

15、? 样品10 STD NTC 外控 样品1 样品2 ? 样品10 STD NTC 7. 打开仪器窗口,按照下图中说明的扩增程序图进行设置。 第一阶段:95 5分钟,1个循环;第二阶段:95 25秒,64 20秒,72 20秒,15个循环; 第三阶段:93 25秒,60 35秒,72 20秒,31个循环; 信号收集:第三阶段60时收集FAM和HEX(或VIC)信号,执行实 时PCR,保存文件。8. 实验结束后,使用2层PE手套包扎好PCR反应条(使用Mx3000P仪器时应该待热盖冷却后再处理,以免烫伤,同时可避免由于PCR管盖较热易开造成污染),并按生物垃圾处理。如非特殊需要,严禁打开PCR管盖,以防造成污染。1. 阴性对照(NTC)的1-7(或A-G)号管的FAM信号应无曲线升起。若7管其中任一管FAM信号升起,则此次实验结果无效,同时建议重做一次。若1-7(或A-G)号管的HEX(或VIC)信号及8(或H)号管的FAM信号偶尔升起,此属正常现象,不影响对突变检测结果的判断。2. 阳性质控品(STD)的Ct值一般小于20,但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。3. 确定试验是否成功可信:(1)外控对照反应孔的FAM信号应该升起。若为石蜡切片样品,则其

展开阅读全文
相关资源
正为您匹配相似的精品文档
相关搜索

最新文档


当前位置:首页 > 办公文档 > 工作范文

电脑版 |金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号