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1、第8章 高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography,特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,8.1 高效液相色谱仪 四大部分组成： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测记录系统（检测器，记录仪等）,1. 高压输液泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,2. 进样装置,
2、流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置,3. 分离系统 包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 6mm，柱长为10 50cm，柱形多为直形，内部充满310 mm高效微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温 匀浆法填充柱： 将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱 液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米,4. 检测器 要求: 灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快, 对温度和流速的变化不敏感 两种类型 溶质型检测器： 仅对被分离组分的物理或理化性质响应 如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器 总体型检测器: 对试样和洗脱剂均有响应 如示差折光
3、，介电常数检测器,UV检测器最常用，占70 池体积: 110L 光程常: 210 mm 波 长: 254 nm 窗 口: 石英,折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）,因 nf（T），故需精密恒温（0.001） 灵敏度低于UV检测器，且不适合于梯度洗脱 用于无紫外吸收的化合物，如糖类,伏安计、安培计、库仑计和电导计等, 首选安培计 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 电极表面易中毒,5. 梯度洗脱 分配比 k 相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开 可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH，以便改变被测组分
4、的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的,梯度洗脱装置分为两类： 外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合样品中各组分的 k 值，使所有谱带都以最佳平均 k 值通过色谱柱。 它在LC中所起的作用相当于GC中的程序升温： 通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值，在GC中借程序调节温度改变k值。,8.2 几种常见的液相色谱形式,1. 液液色谱（分配色谱） 1941
5、年Martin发明: 用吸着在硅胶上的水作为 固定相，用氯仿为流动相 应用范围：最常用方法。 相对分子量小于3000，不带电的极性化合物,分离原理 固定液通过分子间的亲和力或化学键合力附着在粒度很细的惰性载体表面上，被分离的组分溶解在流动相中，并按其分配系数 K 在两相之间进行分配 K不同导致迁移速度不同，从而使不同组分得到分离,固定液的流失 样品一定要在两相中均能溶解才能分,分离，因而两相在某种程度上互溶 长时间使用将导致固定液流失，不利分离 防止固定液流失的方法 ?,防止固定液流失的方法 方法一: 抑制柱 在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理柱，在试样进样前，让流动相预先通过预
6、处理柱，以便使流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失 缺点：麻烦 不能采用梯度洗脱技术,方法二: 化学键合固定相 将固定液以Si-O-R键合在SiO2载体表面,反相色谱 固定液为非极性 洗脱液为极性，如水（常用方法, 75%) C18柱（十八烷基化的SiO2填充柱）为标准色谱柱 应用：醇类、芳香族、蒽醌素、抗菌素、低聚物、甾族化合 物, 维生素等极性不太大的组分,正相与反相液液分配色谱 正相色谱: 固定液为极性，洗脱液为非极性 常用于分离极性化合物，极性大的组分保留时间长，后出峰 固定液： 水、甘油、，氧化二丙腈（极性） 流动相： 己烷、苯、氯仿（非极性）,2. 液固色谱(吸附色谱
7、) 分离原理 固定相为固体吸附剂，被分离组分在固定相上的吸附作用不同来进行分离的 固体相: 极性的硅胶，Al2O3, MgSiO3等 硅胶柱的柱效高，容量大，最常见 流动相 “相似相用”: 如极性大的组分选用极性强的洗脱剂，否则不易被洗脱。洗脱液的极性可用溶剂强度参数 e 表征， e 越大，极性越强 应用 分离极性不同的化学物,同分异构体 不适用同系物的分离,3. 离子交换色谱 1975年 H. Small 发明,现为发展最快的分支 分离原理: 离子交换树脂为固定相,试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生离子交换反应,平衡常数 K = -NR4+X-Cl-/-NR4+Cl-X-,K越大,溶质的
8、离子与离子交换剂的相互作用愈大,保留值愈大 磺酸型阳离子交换树脂,阳离子的保留值大小: 一价阳离子：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ 二价阳离子：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+ 强碱性阴离子交换树脂,保留值大小顺序: PO43-SO42-C2O42-I-HSO4-NO3-CN-NO2-Cl- HCOO-OH-F-CH3COO-,流动相 H2O、H2O + 乙醇、H2O + pH 缓冲剂 应用 无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等,4. 尺寸排阻色谱法 size exclusion chromatography SEC 凝胶过滤色谱: 水为
9、流动相 gel filtration chromatgraphy GFC 凝胶渗透色谱: 非水流动相 gel permeation chromatography GPC 1959年Porath和Flodin发明 分离原理: 试样分子的尺寸和形状不同来实现分离,GPC 流动相: 水、四氢呋喃 应 用: 聚合物的分级 生物聚合体（蛋白质，核酸，低聚糖, 多肽）的分离,8.3 色谱分离方法的选择,了解样品的有关性质 样品的相对分子质量的大小 在水中和有机溶剂中的溶解度、极性和稳定程度 化学结构 熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围,1. 流动相种类与极性,液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂 它
10、可显著改变组分分离状况 选择流动相在液相色谱中特别重要,按组成可分为： 单组分和多组分； 按极性可分为： 极性、弱极性、非极性； 按使用方式可分为：固定组成淋洗和梯度淋洗 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间,选择流动相时应注意的几个问题：,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉
11、淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,8.4 应用实例,方针：要解决一个分析问题，先试反相色谱法 C18标准柱，改变流动相调节k（保留行为）和（选择性）,反相色谱法优点： a.色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱 b.流动相主体为水，甲醇为有机改性剂，价廉易纯化 c.tR 随溶质的疏水性增加而增大，可预计出峰顺序 d.改变基本流动相的pH，添加盐缓冲剂，金属螯和物，手性试剂等，可分离非电离、弱电离、金属离子、手性异构体,多环芳香烃的分析: 反相分配色谱法,固定相： 十八烷基SiO2, 薄壳型 流动相：20%CH3OH/H2O 100% CH3
12、OH, 2%/min 流速：1mL/min 柱温：50 紫外光度检测器（=254nm）,镇痛剂的分析阴离子交换色谱法,固定相：强阴离子交换剂 流动相：pH 9.2+0.005mol/L NaNO3水溶液 流速：1.2mL/min 紫外光度检测器,8.4 进展 柱微型化 高柱效 高分辨率 高选择性 快速分离,High efficiency pCEC separation(500,000plates/m) of 14 explosives in 7 min, See ref. C. Baliey, C. Yan, Anal. Chem., 1998, 70,3275,联用技术,HPLC-AAS H
13、PLC-AFS HPLC-ICP-AES HPLC-UV-Vis HPLC-ICP-MS HPLC-IR,HPLC联用技术在元素的化学形态分析中的应用,元素的化学形态: 元素的生理学毒性大小 对环境的污染程度 在生命过程中所起的作用 如砷化合物毒性大小 砷酸As(V)、亚砷酸AS（III)、甲砷酸、二甲砷酸 它们对实验大鼠的半数致死量分别为: 1.5、5、50、500mg/kg 而砷甜菜碱和砷胆碱(AsC)并未发现对大鼠有毒 仅仅知道元素的总量是不够的，而需要了解它们的形态。,作 业： 试从分离的基本原理、基本理论、检测方式以及应用范围等多方面，对液相色谱与气相色谱进行全面比较。,温 度：10
14、30；相对湿度：80； 最好是恒温、恒湿远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施,8.5 HPLC的日常维护与保养,HPLC的日常操作条件：,工作原理：,手柄位在Load位置时，用微量进样针将样品从进样孔注射进入定量环中(定量环充满后，多余样品从放空孔排出) 手柄转动至Inject位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，将样品进入色谱柱中进行分析,1. 六通阀进样器的使用及保养,手柄转动要快速：手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中途停留,部分装液法：进样量最多为定量环体积的7
15、5 要求每次进样体积准确、相同 完全装液法：进样量最少为定量环体积的3至5倍 将定量环内残留的溶液完全置换样品，达到所要求的精密度及重现性,两种装液方法:,样品必须过滤：用0.45(0.22)m的滤膜过滤 防止微粒阻塞进样阀 减少对进样阀的磨损 进样结束冲洗进样器： 用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗， 在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗 再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧,2. 泵的保养,使用流动相尽量要清洁 进液处的砂芯过滤头要经常清洗 流动相交换时要防止沉淀 避免泵内堵塞或有气泡 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染,在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱 当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净 要注意流动相的脱气 避免使用高粘度的溶剂作为流动相 进样样品要提纯；严格控制进样量,2. 色谱柱的保养,每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭,3. 紫外灯的保养,在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器； 在分析完成后马上关闭检测器,
