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1、第二章 蛋白质的合成、转运、加工与修饰,第一节 蛋白质的合成 第二节 蛋白质合成后的定向输送 第三节 蛋白质合成后的加工与修饰,第一节 蛋白质的合成,转录：以基因的DNA链为模板，以NTP为原料，在RNA聚合酶的作用下，按照AU和GC的碱基配对原则生成mRNA、tRNA和rRNA的过程。 mRNA是指导蛋白质合成的直接模板。 基因表达的最终产物是蛋白质、tRNA和rRNA。,一、信使RNA 二、遗传密码 三、核糖体-蛋白质合成的场所 四、tRNA及氨酰-tRNA合成酶 五、蛋白质生物合成过程 六、翻译的调节 （S）,一、信使RNA（messenger RNA，mRNA）,mRNA的概念首先从理
2、论上提出来，然后再用实验给予证实。 Jacob和Monod（1961）提出mRNA的假设：有一种中间物质传递DNA上的信息。 预言： 信使是一种多核苷酸。 信使的碱基组成应与相应的DNA的碱基组成相一致。 信使的长度应是不同的。 在多肽合成时，信使应与核糖体做短暂的结合。 信使的半衰期很短，所以它的合成速度应该是很快的。,Brenner等用实验证实：用噬菌体T2感染大肠杆菌后，几乎所有在细胞内合成的蛋白质都不再是细胞本身的蛋白质，而是噬菌体所编码的蛋白质；大肠杆菌内出现了少量半衰期很短的新类型RNA，其代谢速度极快，它们的碱基组成与噬菌体DNA是一致的。 Spiegelman用分子杂交技术证明
3、：经噬菌体感染后新合成的RNA可以与噬菌体DNA相杂交。,顺反子：编码一种多肽链并连同起始信号和终止 信号在内的DNA区段。 单顺反子mRNA：编码一种多肽链的mRNA分子。 多顺反子mRNA：编码数种不同多肽链的同一条mRNA分子。多见于原核生物。 反义链/有意义链/（-）链/模板链：双链DNA分子中被转录成RNA转录本的链。 正义链/无意义链/（+）链,（S）,SD序列/核糖体结合位点（ribosomal binding site，RBS）：原核细胞mRNA的翻译起始密码子AUG的上游相距813个核苷酸处有一段由46个核苷酸组成的富含嘌呤的序列，以5-AGGA-3为核心，它与核糖体小亚基上
4、的16S-rRNA 的近3末端处的一段短序列互补。 Kozak序列：a favorable context for efficient eukaryotic translation initiation（PuNNATGPu）。（S） 典型的Poly(A)加尾信号：AATAAA。（S） cDNA末端快速扩增法（rapid amplification of cDNA ends， RACE）（S）,三联体密码（triplet code）/密码子（codon）：mRNA采用每三个相邻碱基编码一个氨基酸。,二、遗传密码,遗传密码和氨基酸的关系表,61个密码分别代表各种氨基酸（amino acid，aa）
5、。一种aa少的只有1个密码（色氨酸和蛋氨酸），多的可有6个，但以2个和4个居多。 终止密码子（terminator codon）：UAA（赭石，ochre）、UGA（蛋白石，opal）和UAG（琥珀，amber）。 起始密码子（initiator codon）/蛋氨酸密码子：AUG（91）/GUG（8）。,遗传密码的特点,1. 连续性（commaless）。三联体密码是不间断的。mRNA链上碱基的插入或缺失可造成框移（frame shift），使下游翻译出的氨基酸完全改变。 2. 通用性（universal）。从最简单的生物一直到人类，在蛋白质的生物合成中都使用同一套遗传密码。哺乳动物线粒体的
6、蛋白质合成体系中有例外！ 3. 简并性（degeneracy)。有两个以上密码子的氨基酸，三联体密码上第一、二位碱基大多是相同的，只有第三位不同。密码子上第三位碱基的变化往往不会影响原有氨基酸的翻译。（密码子的“偏爱性”）,4. 摆动性（wobble）。翻译过程氨基酸的正确加入，需靠mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子相互以碱基配对辨认。密码子和反密码子配对，有时会出现不遵从碱基互补配对的规律，这一现象更常见于密码子的第三位碱基与反密码子的第一位碱基之间，两者虽不严格互补，也能相互辨认（表2-2）。 5. 不重叠性（non-overlapping）。在绝大多数生物细胞中基因的读码规则是不重
7、叠的。例外：少数大肠杆菌噬菌体（如R17、QB等）的RNA基因组中，部分基因的遗传密码是重叠的。,表2-2 密码子和反密码子配对的摆动现象,三、核糖体-蛋白质合成的场所,核糖体（ribosome）/核糖核酸蛋白体：一种非膜性细胞器，由核糖核酸和蛋白质组成。是细胞合成蛋白质的重要场所。它是一种葫芦形的小体，由大小两个亚基组成。在大小亚基的结合面上有一条隧道，是mRNA穿过的通道。在大亚基的中央有一条中央管，是新合成的多肽链释放的通道。,原核生物核糖体结构示意图,1. 受位/ A位点/ 氨酰-tRNA位点：接受氨酰-tRNA的部位。 2. 供位/ P位点/ 肽酰-tRNA位点：肽酰-tRNA移交肽
8、链后，tRNA被释放的部位。 3. 退出位点/ E位点（exit site）：空载的tRNA从此位点被排除。 4. 肽基转移酶位点/ 转肽酶位点：位于大亚基上，是肽链合成过程中催化形成肽键的酶活性部位。 5. GTP酶位点/ 转位酶位点：可水解GTP，为催化肽基-tRNA由A位转到P位提供能量的酶 活性部位。,核糖体活性部位示意图,1. 核糖体单体：核糖体以单体形式存在。 2. 多聚核糖体：核糖体单体由mRNA串联在一起，是合成蛋白质的功能单位。 1. 游离核糖体（free ribosome）：合成结构蛋白质/内泌性蛋白质（endogenous protein），指用于细胞本身或参与组成细胞自
9、身结构的蛋白质。 2. 结合核糖体（fixed ribosome）：合成输出蛋白质（export protein）/分泌蛋白质（secretory protein），指输送到细胞外面，以发挥生物作用的蛋白质。,核糖体的存在形式,核糖体的存在形式,Table 2-3 原核细胞与真核细胞的核糖体理化性质比较,E.coli核糖体小亚单位中rRNA与r蛋白的相互关系示意图线条表示相互作用及作用力的强（粗线）与弱（细线）（引自Alberts et al，1989）,核糖体小亚单位rRNA的二级结构 （a）E. coli 16S rRNA（红色为高度保守区）；（b）酵母菌18S rRNA。 它们都具有类似
10、的40个臂环结构（图中140），其长度和位置往往非常保守；P和E分别代表仅在原核或真核细胞中存在的rRNA的二级结构。（Darnell et al.，1990）,核糖体的功能,细胞内合成蛋白质的重要场所。在蛋白质生物合成中执行两项任务： 1. 使mRNA不断与氨酰-tRNA分子结合。 2. 控制着正在生长中的肽链。,小亚基的功能 1. 将mRNA结合到核糖体上，稳定mRNA与核糖体的结合。 2. 提供一部分A位点。 3. 提供一部分P位点。 大亚基的功能 1. 提供另一部分A位点。 2. 提供另一部分P位点。 3. 提供E位点。 4. 提供肽基转移酶位，肽基转移酶催化肽键的形成。 5. 提供G
11、TP酶位，GTP可以提供蛋白质合成时需要的能量。 6. 提供生长肽链的释放通道（中央管）。,四、tRNA及氨酰-tRNA合成酶,转运核糖核酸（transfer RNA，tRNA）：分子量较小，沉降系数约为4S，约占细胞中RNA总含量的1015，在蛋白质合成时起搬运氨基酸的作用。它对不同的氨基酸有特异性，一种tRNA只能搬运一种氨基酸。 翻译过程中行使“起动”作用的tRNA，能特异地识别起始密码子AUG： 蛋氨酰-tRNA（真核细胞） 甲酰蛋氨酰-tRNA（原核细胞或线粒体）,氨基酸的活化过程示意图,氨酰-tRNA合成酶的专一性,对aa有极高的专一性，每种aa都有一个专一的酶。 只作用于L-氨基
12、酸，不作用于D-氨基酸。 有的酶对aa的专一性并不很高，但对tRNA却有极高的专一性。,五、蛋白质生物合成过程,翻译过程从读码框架的5-AUG开始，按mRNA模板的三联体的顺序延长肽链，直至终止密码出现。活化的aa由tRNA搬运，通过“核糖体循环”的机制，依照mRNA的指令，依次合成肽链。 “核糖体循环”人为地分为三个阶段： 1. 起动阶段翻译起始复合物的生成 2. 肽链的延长 3. 肽链合成的终止,核糖体；mRNA；tRNA；aa；蛋白因子；能量,（1）核糖体亚基的拆离。 利于mRNA和fmet-tRNA结合到小亚基上。 （2）mRNA在核糖体小亚基上就位。 核糖体小亚基上的16S-rRNA
13、的近3末端处的一段短序列与SD序列互补；紧邻SD序列AGGA的小段核苷酸被核糖体小亚基蛋白rps-1辨认结合。,1. 起动阶段翻译起始复合物的生成,（3）fmet-tRNA的结合。fmet-tRNA只能辨认和结合于起始密码子AUG上，推动了mRNA的前移，保证了mRNA就位的准确性。 （4）核糖体大小亚基的结合。加入核糖体大亚基，翻译起始复合物生成。P位被fmet-tRNA和mRNA上的AUG占据；mRNA上仅次于AUG的第二个三联体密码子已相应于A位。,起始因子（Initiation Factor，IF）,（1）IF-1：协助IF2和IF3的作用。 （2）IF-2：使fmet-tRNA结合m
14、RNA及核糖体。IF2先与GTP结合，再结合fmet-tRNA，生成fmet-tRNA-IF2-GTP复合物，同时推动mRNA在30S亚基上移动，使fmet-tRNA到达P位，是一个耗能过程。 （3）IF-3：翻译起始时IF3结合到核糖体30S亚基靠近50S亚基的边界，使大小亚基拆离。,（1）肽链延长的第一步：进位 1个GTP、EFTu和EFTs。,2. 肽链的延长,（2）肽链延长的第二步：成肽 在转肽酶的催化下，P位上的tRNA所携的甲酰蛋氨酰基转移给A位上的新进入的氨酰-tRNA，形成肽链。原在P位上的、脱去甲酰蛋氨酰基的tRNA从复合物中迅速脱落，使P位留空。,（3）肽链延长的第三步：转
15、位 在转位酶/延长因子G（EFG）的催化下，在A位的二肽连同mRNA从A位进入P位。实际是整个核糖体的相对位置移动。第三位氨基酸按密码的指引进入A位注册，开始下一轮循环。（蛋氨酸氨基肽酶；1个GTP）,延长因子（Elengation Factor，EF）,（1）EF-Tu：按mRNA编码序列携带氨酰-tRNA进入A位。 （2）EF-Ts：使EF-Tu和GTP再生，参与肽链延长。 （3）EF-G：具有转位酶活性，使肽酰-tRNA从A位转移到P位。,终止密码子的辨认；肽链从肽酰-tRNA水解出来；mRNA从核糖体中分离；大小亚基的拆开。,3. 肽链合成的终止,释放因子（RF，RR）,释放因子（re
16、lease factor，RF）：辨认终止密码子和促进肽链C端与tRNA 3-OH酯键的水解，使肽链从翻译中的核糖体上释放下来。 （1）RF-1：辨认UAA和UAG，进入A位。 （2）RF-2：辨认UAA和UGA，进入A位。 （3）RF-3：激活核糖体上的转肽酶。转肽酶受RF3作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，水解肽酰-tRNA的酯键，使P位上的肽与tRNA分离。 核糖体释放因子（RR)：使tRNA、mRNA及RF均从核糖体脱落。,合成20 aa的多肽需要消耗多少分子的高能磷酸键的能量？,20 2 + 1 + 19 2 79,1. mRNA自身结构。 （1）翻译起始密码子及两端侧翼序列；SD序列及两端 侧翼序列。（通常，SD序列的中心碱基与其下游起始密码子之间保持8个核苷酸距离时，被最有效翻译；这个区段突变会显著降低翻译效率。） （2）翻译起始区（TIR）。该区域的分子内碱基配对会影响SD序列的功能。 （3）mRNA的密码子。（丰富tRNA识别密码子和稀有tRNA识别密码子）,六、翻译的调节（S）,2. 反义RNA：同某种天然的mRNA反向互
