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1、1,猪伪狂犬病防控探讨 -临床应用篇,陈家锃 博士/主任 15066253812 2017年8月22日,2,个人介绍,1、预防兽医学博士,师从童光志所长、李一经院长和田志军研究员; 2、从事高致病性蓝耳病HuN4-F112的研制及大量的临床试验工作; 3、参加国家中长期项目(2008-2020),猪瘟和伪狂犬净化工作;,3,2011年所在团队最早发现了猪伪狂犬变异株,并开展疫苗的研制和伪狂犬疾病的防控工作,国际首次报道 IF 7.327,国内首次报道,Virulent Pseudorabies virus (vPRV) (超强毒) Pseudorabies Virus Variant (变异株
2、),4,目前主要从事猪病的临床防控及实验室诊断工作 擅长的领域: 猪场的免疫程序评估及调整 猪疫苗评估的动物实验设计 病毒性疾病诊断及综合防控,5,每个猪场都面临伪狂犬感染的威胁 不同猪场和感染的不同阶段的表现 如何通过实验室确诊和防控伪狂犬 如何科学地发挥伪狂犬疫苗的作用 伪狂犬“五步法转阴”及注意事项,主要内容,6,一、每个猪场都面临伪狂犬感染的威胁,伪狂犬病毒的特性: 1、病毒对外界的抵抗力强 从发病猪排泄的病毒,37 10天,25 40天,15 120天仍存活; 2、伪狂犬的中间宿主多,散毒方式多样,猪最具耐受性,是自然界病毒唯一的贮存宿主。 此外,牛、羊、马、狗、猫、鼠等都能被伪狂犬
3、病毒感染并散毒,体内可在多个脏器内繁殖,繁殖快。 散毒途径多样,可通过唾液、精液等方式散毒,7,自然感染的途径: 经鼻感染和经口感染 空气传播 老鼠的传播 苍蝇的传播 虱子传播 妊娠猪感染给胎儿的途径: 交配时感染病毒的持续感染 通过白血球传送病毒(病毒血症时间短,很难检测到),通过神经节传播,很难防控 病毒在初感染部位的鼻粘膜,咽喉头粘膜,扁桃繁殖,其次在其附近的淋巴结繁殖。 在上部呼吸道繁殖的病毒借助三叉神经,嗅觉神经,舌咽神经到达中枢神经,引起脑炎。 增殖的病毒如果到达肺部,在肺部迅速繁殖,引起肺炎。,8,少量的病毒即可感染 大量排毒 潜伏感染 隐性感染,3、病毒在猪体内的特征:,9,接
4、种病毒量和感染成立(岛田,2006),伪狂犬病毒的最低感染剂量只有猪蓝耳的1/30,注:任何疾病都有感染的最小剂量,低于最小剂量后猪不会感染,更不会发病;,10,仔猪感染后短时间内会呈百万倍地排毒,PRV接种后病毒分离阳性率及病毒排泄量(岛田,2006),感染3-5天的口腔试子和鼻腔试子排毒量4.0-8.0Log10TCID50,感染8-17天的口腔试子排毒量5.9-8.3Log10TCID50,感染18-25天的口腔试子排毒量6.0Log10TCID50,高峰时空气中的病毒量为5.3Log10TCID50 按照极致计算,一头猪感染后的3-5天的排毒量可以感染100万头生猪,11,被感染猪不表
5、现临床症状,病毒粒子本身检测不到,但感染猪终生带毒。 病毒的遗传子潜伏在神经细胞内,当免疫低下时,遗传子再活性化引起在感染。 被感染猪表现亚临床症状,这种带毒猪可持续一年以上排毒。 潜伏感染猪和隐性感染猪成为污染源,12,PRV的侵入途径-种猪引进和育肥猪散毒是已知的主要传染源,(美国农务省的调查结果),一点式饲养散毒风险大,伪狂犬阴性场引进后备必须经过检测确定为伪狂犬阴性!,13,综上所述,大多数猪场都存在伪狂犬发病的风险;中小规模猪场的风险尤为突出;,小结,伪狂犬病毒感染剂量低,中间宿主多,猪感染后排毒量巨大,进入猪场途径多,猪场内传播快,公猪传播途径容易被忽视;,14,变异株的流行导致发
6、病率持续上升,2011年以前,由于疫苗普遍接种(很多猪场仔猪只做一针的情况下)临床典型病例已较少; 配合鉴别诊断技术,很多猪场实现了伪狂犬转阴或者净化;,15,变异株的流行导致发病率持续上升,自2011年底自北向南猪场陆续出现伪狂犬;经过鉴定不同省份分离的毒株都是高度同源的变异株;,2011年底最初发生的省份,至2015年伪狂犬变异株的分布,16,PRV HeN1和S株 对小鼠的LD50测定,PRV HeN1和SC株Vero细胞培养液的毒价测定分别为107.6 TCID50/0.1mL; 106.8TCID50/0.1mL。 将原液稀释为106.0、105.0、104.0、103.0、102.
7、0、101.0TCID50/0.1mL; 30只5周龄BALB/c小鼠,随机分为6组,每组5只,皮下注射各稀释度病毒0.1mL; 逐日观察小鼠症状及死亡情况。 PRV- HeN1 株对小鼠的LD50经计算为102.4TCID50/只。 PRV-SC株 对小鼠的LD50经计算为103.8TCID50 /只。,变异株伪狂犬的致病力更强,致死剂量为国家校检毒株SC株的1/30,17,Tong , et al., Vet. Microbiol. 181 (2015) 236240 .,变异株对仔猪的致死率更高,18,注: 1、实验设计、免疫剂量和攻毒剂量均参照Bartha K61疫苗质量标准; 2、绵
8、羊对伪狂犬感染是致死性的 3、免疫是单针肌注免疫,现有质量标准的疫苗对变异株(HeN1)的攻毒保护效果欠佳,19,2014年7月-2015年的检测数据统计,20,2016年检测数据统计数据,21,伪狂犬变异株的临床症状变化,初次感染场特别是野毒抗体阴性场,损失惨重。 母猪以流产、死胎木乃伊胎为主; 仔猪出生后3-5天神经症状,腹泻、呕吐,死亡率100%; 伪狂犬野毒抗体呈阴性猪场,迅速转阳,一个月内gE抗体阳率超过50%。 感染后1年产房逐渐平稳(但持续感染的影响在继续) 神经症状比例减少,腹泻比例增高; 保育及育肥猪干咳及继发感染严重;,22,长期免疫抑制or传胸混感?,可致死大量育肥中后期
9、猪 母猪屡配不孕,返情率高 产房仔猪顽固持续性腹泻 猪群精神抑郁具有攻击性,23,规模化场和中小规模的猪场表现的问题不同,规模化场具有较强的处置能力与诊断能力 反复加强免疫 种猪4次/年,仔猪3次/年 加大剂量免疫 种猪3头份/次,仔猪2头份/次 实际效果: 注射时应激大,多次注射,操作麻烦; 可控制临床主要症状(如流产及仔猪神经症状等),但偶有干咳、腹泻等症状 120-150日龄猪群转阳率高居不下。,24,中小规模场主要问题误诊为其他疾病,呼吸道症状和繁殖障碍(母猪流产、返情)容易误认为是蓝耳和圆环,25,伪狂犬引起的腹泻与PEDV症状相近,容易被经验所蒙蔽,检测中心二月份采集很多疑似PED
10、V的病料,最终检测结果为伪狂犬引起的腹泻,26,近年来伪狂犬发病率高,带毒率高,已成为危害我国生猪养殖的最重大疫病之一; 伪狂犬病在呼吸道、消化道、繁殖障碍类疾病中的病原检出率较高,部分症状与蓝耳和PEDV类似; 伪狂犬变异株发病重要的特点: 必然的几个阶段:流产-木乃伊和神经症状-顽固性腹泻和育肥干咳-长期感染散毒导致育肥期猪群的死亡; 感染后的猪场呈亚临床发病,主要问题是仔猪顽固性腹泻和保育及育肥猪干咳。,小结,27,三、如何利用实验室检测防控伪狂犬,常用的伪狂犬检测方法: ELISA:gB抗体,gE抗体 中和抗体检测 病原检测:普通PCR与荧光定量PCR 病理切片,28,三、如何利用实验
11、室检测防控伪狂犬,伪狂犬疫苗是少有的可通过抗体检测区分野毒和疫苗毒的疫苗,目前大多数伪狂犬疫苗是缺失gE基因的,因此疫苗免疫不会产生针对gE基因的抗体,因此可以通过鉴别诊断技术确定猪场的感染情况。 那么检出野毒抗体意味着什么?是不是猪群在发病或者仔猪感染?,29,野毒抗体检测的误区,阳性猪场检母猪的抗体 伪狂犬一旦感染终生带毒,野毒抗体持续为阳性母猪,不可能通过免疫将野毒阳性的母猪转阴,更不能因为母猪野毒抗体是阳性就判断猪场有问题; 阳性场90日龄之前的仔猪判断为伪狂犬感染 伪狂犬的母源抗体持续期长,母猪野毒抗体阳性仔猪必为阳性,但不能确诊为野毒感染;,30,野毒抗体检测的应用范围,接种PRV
12、 HeN1后,第5天部分猪PRV gE抗体开始阳转,第7天全部阳转。 猪场检测PRV野毒是否正在流行应以检测后备猪(14-18周)gE抗体为主,超过15%为正在流行。 阳性的母猪可产出阴性的后备,通过这一指标可评价疫苗的保护效果,阳性场,31,野毒抗体检测的应用范围,野毒阴性场可用于监测 新引进种猪:凡阳性必淘汰,剩余公猪可反复间隔2周检测,均为阴性可用; 仔猪按日龄采血,确定猪场的感染阶段,采取针对性措施;,32,普通PCR和荧光定量PCR 样品:扁桃体(持续带毒),肺脏(呼吸道症状),脑组织(神经症状),鼻腔试子(育肥期检测),精液(如血清抗体gE阳性,必检) 感染压力评估时用荧光定量PC
13、R 误区: 伪狂犬的病毒血症期极短,血清样本往往检测不到病原; 公猪精液的病原检测容易被忽视 病原检测是测序的基础,病原检测的误区及应用范围,33,四、伪狂犬疫苗的作用及正确应用,1、伪狂犬病疫苗可有效保护强毒的攻击而免于临床发病。 2、弱毒疫苗的保护效果比灭活苗好且免疫持续期长 3、伪狂犬活苗注射免疫会受到母源抗体的干扰,滴鼻免疫是有效的免疫途径(1)不受母源抗体干扰;(2)建立黏膜免疫阻止病原经过呼吸道传播途径; 4、伪狂犬的母源抗体持续期特别长,在感染压力比较大的场,为尽早肌注免疫,建议在妊娠中后期母猪不要免疫伪狂犬疫苗; 5、伪狂犬是少有的几个可以做紧急免疫的疫苗,断奶后仔猪出现伪狂犬
14、引起的干咳及腹泻症状或瘙痒症状,紧急注射伪狂犬可有效缩短病程和发病率; 6、对育肥猪注射伪狂犬疫苗,特别是一点式猪场;,34,五、伪狂犬“五步转阴”法,35,伪狂犬温和净化的关键点,1、疫苗株要能有效压制散毒-不扩大感染压力 2、快速产生主动保护-通过佐剂缩短空窗期 3、阳性母猪可产阴性后备-阴性后备补充 4、控制公猪精液传播-预防再次感染母猪群 5、按照产次自然淘汰-逐渐降低猪群的风险 6、生物安全灭鼠工作-保卫净化成果 7、配套的检测方法-评估猪场感染压力,36,感染压力分析,保证后备的阴性,阳性母猪随产次自然淘汰,定期抗体监测,1,2,3,4,5,伪狂犬“五步转阴”步骤,活跃度评估,压制散毒,后备净化期,稳定自然淘汰期,验收监测期,公猪淘汰及疫苗压制(包括育肥)、生物安全,37,第一次种猪伪狂犬gE抗体检测情况,38,调整免疫程序后半年后检测数据,39,淘汰阳性种公猪后的结果,40,1年后净化结果,41,2年后净化结果,42,加强型疫苗技术核心: 快速起效,免疫空窗期短 安全有效,保护时间更久 配套的检测技术: 评估感染压力,了解感染阶段 可鉴别可诊断,减少误判错判 转阴和净化成本: 不干扰生产秩序,不增加生产成本 成本可控,经济有效 第二阶段即达到减少伪狂犬床危害,最终达到转阴净化目的,降低远期风险,五步法转阴的优势,43,