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1、 制药分离工程实验指导四川理工学院制药分离工程实验指导第一版制药工程系 编二一二 年制药分离工程试验 目录目 录实验一 细胞 SOD 的提取和分离 .- 1 -实验二 大枣中多糖的提取分离 .3实验三 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶 .5实验四 柱层析法对色素的提取与分离 .7实验五 质粒的提取及电泳分离 .9实验六 八角茴香油的提取与检识 .11实验七 秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定 .14实验八 大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷 .16实验九 重结晶及过滤 .18实验十 简单蒸馏及分馏 .3制药分离工程实验 细胞 SOD 的提取和分离实验一 细胞 SOD 的提取和分离一、实验目的 1
2、掌 握 有 机 溶 剂 沉 淀 法 的 原 理 和 基 本 操 作 。2 掌 握 SOD 酶 提 取 分 离 的 一 般 步 骤 。二、实验原理超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase， SOD)是 一 种 具 有 抗 氧 化 、 抗 衰 老 、抗 辐 射 和 消 炎 作 用 的 药 用 酶 。 它 可 催 化 超 氧 负 离 子 (O2-)进 行 歧 化 反 应 ， 生 成 氧和 过 氧 化 氢 。 大 蒜 蒜 瓣 和 悬 浮 培 养 的 大 蒜 细 胞 中 含 有 较 丰 富 的 SOD， 通 过 组 织或 细 胞 破 碎 后 ， 可 用 pH7.8 的 磷
3、酸 缓 冲 溶 液 提 取 出 来 。 由 于 SOD 不 溶 于 丙 酮 ，可 用 丙 酮 将 其 沉 淀 析 出 。有 机 溶 剂 沉 淀 的 原 理 是 有 机 溶 剂 能 降 低 水 溶 液 的 介 电 常 数 ， 使 蛋 白 质 分 子 之 间的 静 电 引 力 增 大 。 同 时 ， 有 机 溶 剂 的 亲 水 性 比 溶 质 分 子 的 亲 水 性 强 ， 它 会 抢 夺 本 来与 亲 水 溶 质 结 合 的 自 由 水 ， 破 坏 其 表 面 的 水 化 膜 ， 导 致 溶 质 分 子 之 间 的 相 互 作 用 增大 而 发 生 聚 集 ， 从 而 沉 淀 析 出 。三、试剂
4、与仪器1.试剂与材料新鲜蒜瓣 、 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） 、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 、丙酮：用前需预冷至 4-10 、0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（pH10.2） 、0.1mol/LEDTA 溶液 、2mmol/L 肾上腺素溶液2. 仪器 恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒四、实验步骤1. 组织细胞破碎：称取 5g 大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。 2. SOD 的提取：破碎后的组织中加入 2-3 倍体积的 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） ，继续研磨 20min，使 SOD 充分溶解到缓冲液中，然后在 5000
5、rpm 下离心 15min，取上清液。 3. 除杂蛋白：上清液加入 0.25 体积的氯仿-乙醇混合液搅拌 15min，5000rpm 离心15min，得到的上清液为粗酶液。 4. SOD 的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min，5000rpm 离心 15min，得SOD 沉淀。将 SOD 沉淀溶于 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）中，于 55-60热处理15min，得到 SOD 酶液。 5. SOD 活力测定 将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的 SOD 活力。 试剂 空白管 对照管 样品管碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0EDTA 溶液 0.5 肾上腺
6、素溶液 肾上腺素溶液蒸馏水 0.5 0.5 -样品液 - - 0.5混合均匀，在 30水浴中预热 5min制药分离工程实验 细胞 SOD 的提取和分离肾上腺素溶液 0.5 0.5加入肾上腺素后，继续保温 2min，然后立即在 480nm 处测定光密度。对照管和样品管的光密度值分别为 A 和 B。 在上述条件下，SOD 抑制肾上腺素自氧化 50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即： 酶活力（单位）=2（A-B）N/A 式中，N样品稀释倍数；2抑制肾上腺素自氧化 50%的换算系数。 五、实验结果 根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。 六、注意事项1. 酶液提取时，为了尽可能保持
7、酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。 2. 肾上腺素容易被氧化，故操作时要尽量快。 以对单糖混合液进行分离。以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系七 、 思 考 题1.计 算 出 每 500g 大 蒜 蒜 瓣 所 制 备 出 的 SOD 酶 的 克 数 。2.讨 论 有 机 溶 剂 沉 淀 法 与 盐 析 法 相 比 的 优 缺 点 。制药分离工程实验 大枣中多糖
8、的提取分离实验二 大枣中多糖的提取分离一 、实验目的1、学习多糖的提取分离方法及工艺2、熟悉萃取、离心、蒸发、干燥等单元操作3、掌握苯酚硫酸法鉴定多糖的方法。二 、实验原理多糖化合物作为一种免疫调节剂，能激活免疫细胞提高机体的免疫功能，对正常的细胞没有毒副作用，在临床上用来治疗恶性肿瘤、肝炎等疾病。大分子植物多糖如淀粉、纤维素等多不溶于水，且在医药制剂中仅用作辅料成分，无特异的生物活性。而目前所研究的多糖，因其分子量较小，多可溶于水，因其极性基团较多，故难溶于有机溶剂。多糖的提取方法通常有以下三种。(1)直接溶剂浸提法：这也是传统的方法，在我国已有几千年历史，如中药的煎煮、中草药有效成分的提取
9、。该方法具有设备简单、操作方便、适用面广等优点。但具有操作时间长、对不同成分的浸提速率分辨率不高、能耗较高等缺点。(2)索氏提取法：在有效成分提取方面曾经有过较为广泛的应用，其提取原理：在索氏提取中，基质总是浸泡在相对比较纯的溶剂中，目标成分在基质内、外的浓度梯度比较大；在回流提取中溶液处于沸腾状态，溶液与基质间的扰动加强，减少了基质表面流体膜的扩散阻力，根据费克扩散定律，由于固体颗粒内外浓度相差比较大，扩散速率较高，达到相同浓度所需时间较短，且由于每次提取液为新鲜溶剂，能提供较大的溶解能力，所以提取率较高。但索氏提取法溶剂每循环一次所需时间较长，不适合于高沸点溶剂。(3)新型提取方法：随着科
10、学技术的发展，近年出现了一些新的提取方法和新的设备，如超声波提取、微波提取以及与膜分离集成技术，极大地丰富了中草药药用成分提取理论。此外还有透析法、柱色谱法、分子筛分离法及中空纤维超滤法等。可根据原料及多糖的特点，设计不同的提取工艺。本实验采用直接溶剂浸提法提取大枣多糖。三 、试剂与仪器试剂：大枣，无水乙醇，浓硫酸，苯酚（常压蒸馏，收集 182馏分） ，蒸馏水。仪器：电热恒温水浴锅，磁力搅拌器，电子天平，真空干燥箱，低速离心机，旋转蒸发仪，家用多功能粉碎机；锥形瓶，量筒，容量瓶，试管，移液管，玻璃棒，烧杯、蒸馏头。四 、实验步骤(1)大枣多糖的提取制药分离工程实验 大枣中多糖的提取分离将大枣烘
11、干，粉碎，称取枣粉 15g，装入 250mL 的锥形瓶中，并加入 200mL 的蒸馏水。开动磁力搅拌器搅拌，在 80恒温水浴提取 1h。将大枣提取液离心，得到上清液，并定容于 200mL 容量瓶中，从中移取 10mL 于10mL 试管中，以备鉴定。剩余上清液 45在旋转蒸发仪减压浓缩至原提取溶液体积的 1/2，浓缩液中加220mL 无水乙醇，使溶液乙醇含量达到 70%，静置 2h 后离心分离，收集多糖沉淀，加入多糖沉淀 1 倍体积的无水乙醇洗涤，离心分离后将沉淀物放入 45真空干燥箱，干燥至恒重得大枣粗多糖。提取率计算提取率=(干燥大枣粗多糖/原枣粉重量)100%(2)多糖的鉴定 5%苯酚溶液
12、的配制：取苯酚 100g，加铝片 0.1g 和 NaHCO3 0.05g，蒸馏收集 182馏分，称取此馏分 25g，加水 475g，置于棕色瓶放入冰箱备用。 移取大枣多糖提取液三份各 2.5mL，标为 1 #，2#，3 #样，分别定容于50mL、100mL、200mL 容量瓶中。 分别移取 1 #，2#，3 #多糖溶液 1mL 于 10mL 试管中，然后依次加入 1.6mL 的 5%苯酚溶液，7mL 浓硫酸，振荡摇匀后室温冷却，观察溶液颜色变化。五、实验结果与讨论 记录试验条件、过程、各试剂用量及产品的重量，并计算大枣多糖的提取率，填写下表。产品为暗红色固体。观察大枣多糖鉴定过程中的溶液颜色变化，记录试验现象。填写下表 1。 表 1 大枣中多糖的提取率及鉴定结果组别 多糖重量 提取率 溶液颜色变化1#
