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1、8.3 PCR扩增未知DNA片段,当获得一段DNA后，若要得到与其相邻的未知DNA片段，可通过染色体步查来完成。 染色体步查是指从生物基因组或基因组文库中的已知 序列出发，逐步获得或探知其相邻的未知序列或与 已知序列呈共线性关系的目的序列的核苷酸组成的 方法和过程。,8.3.1 反向PCR,反向PCR（inverse PCR）是一种简单的扩增已知 序列周边未知序列的方法，其扩增原理见图8-8。 首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中 至少有一个环状分子含有完整的已知片段。 根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。,图
2、8-8 反向PCR原理示意图,8.3.2 利用接头的PCR,这类方法的第一步通常都是将基因组DNA用限制性内切酶切割，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段两端，以提供PCR需要的另一端引物。 根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，可将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。,巢式PCR反应模式图,图8-9 利用3末端修饰的接头扩增未知DNA片段,接头一端为平末端，另一端为长长的5突出末端，而且在3凹端带有一个修饰氨基(-NH2)，修饰的末端在PCR扩增时不能作为引物启动DNA的合成。 首先选择合适的酶切位点酶切总基因组，将人工合成的接头连接在酶切片段两端，然后再做PCR扩增。 PCR扩增的
3、引物是根据接头的突出末端序列而设计的引物LP1和LP2，以及根据已知序列设计的引物SP1和SP2。,8.3.3 热不对称交错PCR,TAIL-PCR: thermal asymmetric interlaced PCR 利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段 利用特异引物和随机引物进行PCR一般有3种产物生成：由特异性引物和简并引物扩增出的产物(I型产物）；由同一特异性引物扩增出的产物（II型产物）；由同一简并引物扩增出的产物（III型产物）。,TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列 设计3个嵌套的特异性引物（special primer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp）
4、，用它们分别和1个具有 低Tm值的短的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，AD，约14bp）相组合，以基因组为模板， 根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度 循环，通过分级反应来扩增特异引物。 TAIL-PCR共分3次反应。,TAIL-PCR用特殊的热循环程序使PCR反应有利于型产物的扩增，而抑制型非特异性产物。 其中使用较长的高退火温度的嵌套特异引物和较短的低退火温度的随机简并引物，它们的退火温度明显 不同。 通过控制退火温度可控制何种引物占优势，从而控制产物的扩增。,首先进行5轮高严谨度的扩增，此时主要是特异性的引物起作用，单向扩增目的单链DNA。 然后进行一个低严谨度的PCR循环，随机简并引物起作用，此前线性扩增的目的DNA产物可变成双链。 在随后的扩增中高严谨度和中严谨度循环交错进行，使目的序列扩增大大超过非特异产物，从而控制特异产物和非特异产物的生成比例（图8-10）。 最后再使用一个嵌套特异性引物进行第二次TAIL-PCR，可以得到大量的特异性产物。,图8-10 TAIL-PCR工作流程图,
