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1、DNA分子标记鉴定,分子生药学molecular pharmacognosy,在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学，所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。,分子生药学研究内容,DNA分子遗传标记,以形态学为主的生药鉴定方法(性状鉴别、显微鉴别)和理化鉴别，还不能解决所有生药的真实性鉴定问题，特别是对同属多来源生药及种内的一些变异 ( 道地药材 ) 、动物药等难以专属性地鉴定。 学科发展的需要以及分子生物学技术的飞速发展使 DNA 分子遗传标记（ DNA molecular genetic marker ）鉴别生药应运而生 。,道地药材
2、,道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用公式表示： 表现型phenotype=基因型genotype+环境饰变（environmental modification）,生药 DNA 分子遗传标记鉴定是指通过比较生药间 DNA 分子遗传多样性差异来鉴别生药基源，确定其学名的方法。,DNA 分子是由 G 、 A 、 C 、 T 四种碱基构成，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，这就是生物的遗传多样(genetic diversity)。,在 DNA 分子上，有编码与物种存活密切相关的基因区域、编码与物种存活不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。 基因组 DNA 的这
3、些不同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，前者所受选择压力大，表现出高度保守，后者所受选择压力小，表现出较大的变异。,正是由于这种 DNA 分子不同区域承受的选择压力不同，使得 DNA 分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此，我们能够选择适当的 DNA 分子遗传标记，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确地鉴别。 下面对生药 DNA 分子遗传标记鉴定的相关技术和方法作一简单介绍。,一、DNA提取技术,DNA 的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。 总 DNA 的有效提取要求材料中的 DNA 尽可能少的降解。,从植物药材中提取 DNA 一般可分为两个阶段: 第一阶段
4、是植物细胞破裂后释放出 DNA 。 第二阶段是 DNA 与其它细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离，在这个阶段，重要的是要保证大量的 DNA 不能混杂在细胞碎片中， DNA 要与蛋白质和其它污染物完全分离，因为这些污染物的存在会干扰下一步的分析。,对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），一般方法都可以得到质量符合要求的 DNA 。 但对于中药材，情况则要复杂得多，需要针对具体材料，设计去除含酚羟基的化合物和多糖类化合物的方法。,DNA 的质量将直接关系到实验的成败。 一般而言，所得的 DNA 应完整、有足够的量，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型，此外，还应满足下游操
5、作的要求，如用于 PCR 分析的 DNA 不应含干扰 PCR 反应的污染物。,二、琼脂糖凝胶电泳技术,琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片段的常用方法，具有简便、快速的优点。 DNA 琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同。 DNA 分子是两性电解质， 在高于其等电点的溶液（ pH8.0pH8.3 ） 中 ，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离， DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动,DNA 分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应， 使分子大小和构象不同的 DNA 分子迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。 在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入 DN
6、A 的碱基之间，因此可在紫外光灯下直接观察到 DNA 片段在凝胶上的位置，并可在紫外光灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。,三、PCR技术,聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction ， PCR) 是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，是一种模拟自然 DNA 复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术。,PCR 技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一 DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，在EB染色及电泳后，肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测鉴定。,DNA复制特点,1. PCR 技术的基本原
7、理,类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性 - 退火 - 延伸三个基本反应步骤构成： 模板 DNA 的变性 模板 DNA 经加热至 93 左右一定时间后，模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮循环作准备； 模板 DNA 与引物的退火 ( 复性 ) 模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；, 引物的延伸 DNA 模板 - 引物结合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半
8、保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性 - 退火 - 延伸三过程，就可获得更多的 “ 半保留复制链 ” ，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2 4 分钟， 2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,2. 参加 PCR 反应的物质,主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg 2+ 。 （ 1 ）引物 是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸
9、链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。,（ 2 ）酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U( 指总反应体积为 100l 时 ) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,（ 3 ） dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的缓冲液将其 pH 调节到
10、 7.0 7.5 ，小量分装， -20 冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。,在 PCR 反应中， dNTP 的浓度应为 50 200mol/L ，尤其应注意 4 种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制 ) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 ( 偏高或偏低 ) ，就会引起错配。浓度过低还会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg 2+ 结合，使游离的 Mg 2+ 浓度降低。,（ 4 ）模板 ( 靶基因 ) 质量 是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇
11、或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。 RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚 /SDS 法等，要防止 RNase 降解 RNA 。,（ 5 ） Mg 2+ 浓度： Mg 2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200mol/L 时， Mg 2+ 浓度为 1.5 2.0mmol/L 为宜。 Mg 2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。,四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法,DNA分子标记技术 以传统的southern杂交为基础的分子标记技术
12、RFLP限制性内切酶片段长度多态性 以PCR为基础的分子标记技术 RAPD 随机扩增多态性DNA SCAR 测序的扩增区段 STS 测序的标记位点 DAF DNA扩增产物指纹分析,以PCR和RFLP相结合的分子标记技术：AFLP 扩增的限制性内切酶片段长度多态性 以重复序列为基础的分子标记技术 Satellite:卫星DNA(重复单位为几百几千碱基对) Microsatellite:微卫星DNA(重复单位为25碱基对) SSR：短重复序列,（一）限制性片段长度多态（ restriction fragment length polymorphism ，简称 RFLP ）,生物在进化过程中，由于种
13、种原因引起的基因突变和 DNA 分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，在一处或几处发生某种差异，当这种改变（即使是很小的改变）涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的 DNA 片段长度将发生变化，即限制性酶谱的条带方式将出现不同，产生多态性，称为限制性片段长度多态。,一般应用 Southern 杂交检测这种多态性，将琼脂糖凝胶中的 DNA 转移到硝酸纤维素膜（或其它膜）上，然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放射自显影后即可在 X 光片上看到 DNA 多态性了。 该方法试验步骤繁琐（包括 Southern 转移、探针标记、杂交、检测等），又受到探针来源的限制，所需 DNA 样品量大（
14、因没有对 DNA 进行扩增），仅适于 DNA 未明显降解的新鲜材料。,（二）随机扩增多态性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(AP-PCR) （ arbitrary primer PCR ）,RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美国杜邦公司科学家 J. G. K. Williams 和加利福尼亚生物研究所 J. Welsh 领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。 Williams 称之为 RAPD ， Welsh 称之为 AP-PCR 。,RAPD
15、 技术建立在 PCR 技术基础上，它是以任意序列的寡核苷酸单链 ( 通常为 10 个碱基， AP-PCR 则为 20 30 个碱基 ) 为引物，对所研究的基因组 DNA 进行随机扩增。 RAPD 所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组 DNA 序列有特定的结合位点。,这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR 扩增的反应条件，即在一定范围内模板 DNA 上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的 DNA 片段。 在不同物种基因组 DNA 中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR 扩
16、增产物增加、减少或发生分子量的变化。 通过对 PCR 产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组 DNA 的多态片段。,与常规 PCR 相比， RAPD 主要有以下特点： 无需专门设计 RAPD 扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为 9 10 个寡核苷酸。 每个 RAPD 反应中，仅加单个引物，通过引物和模板 DNA 链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。, 退火温度较低，一般为 36 ，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组 DNA 中配对的随机性。 较之常规 PCR ， RAPD 反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量 DNA 分子标记，可以借助计算机进行系统分析。,该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个领域。在生药鉴定方面，该方法在人参及其伪品、甘草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中有应用。,（三）扩增片段长度多态性标记（ amplified fragment length polymo
