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1、专题 1 基因工程专题 1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因技术，体外 DNA 重组和转基因技术， 赋予生物以新的遗传特性新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程 是在 DNA 分子水平DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做 DNA 重组技术DNA 重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链 DNA 分子的某种特
2、定特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开，因此具有专一专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式：黏性末端黏性末端和平末端平末端。 2.“分子缝合针”DNA 连接酶DNA 连接酶 (1)两种 DNA 连接酶（EcoliDNA 连接酶和 T4-DNA 连接酶）的比较： 相同点：都缝合磷酸二酯磷酸二酯键。 区别：EcoliDNA 连接酶来源于 T4噬菌体噬菌体，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端黏性末端之间 的磷酸二酯键连接起来；而 T4DNA 连接酶能缝合两种末端两种末端，但连接平末端的之间的效率较 低低。 (
3、2)与 DNA 聚合酶作用的异同:DNA 聚合酶只能将单个核苷酸单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端， 形成磷酸二酯键。DNA 连接酶是连接两个 DNA 片段两个 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”载体载体 （1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存能在受体细胞中复制并稳定保存。 具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入。 具有标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择具有标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具裸露的、结构简单
4、的、独立于细菌染色体之外，并具 有自我复制能力的双链环状 DNA 分子有自我复制能力的双链环状 DNA 分子。 （3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取目的基因的获取 1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 编码蛋白质的结构基因 。 2.原核基因采取直接分离直接分离获得， 真核基因是人工合成人工合成。 人工合成目的基因的常用方法有反转反转 录法录法_和化学合成法化学合成法_。 3.PCR 技术扩增目的基因 （1）原理：DNA 双链复制DNA 双链复制 （2）过程：第一步：加热至 9095DNA 解链DNA
5、解链；第二步：冷却到 5560，引物结合到互引物结合到互 补 DNA 链补 DNA 链；第三步：加热至 7075，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建基因表达载体的构建 1.目的 ： 使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以遗传至下一代遗传至下一代，使目的基因能够表达表达 和发挥作用和发挥作用。 2.组成：目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA 片段DNA 片段，位于基因的首端首端，是 RNA 聚合酶RNA 聚合酶识别和结合 的部位，能驱动基因转
6、录出 mRNA转录出 mRNA，最终获得所需的蛋白质蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的 DNA 片段 DNA 片段 ，位于基因的尾端尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因是否含有目的基因，从而将含有目的基因的含有目的基因的 细胞细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法
7、农杆菌转化法，其次还有 基因枪法 基因枪法和 花粉花粉 管通道法管通道法等。 将目的基因导入动物细胞 ： 最常用的方法是 显微注射技术 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵 受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传 繁殖快、多为单细胞、遗传 物质相对较少 ，物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ， 大肠杆菌 ，其转化方法 是：先用 Ca Ca2+ 2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ， 感受态细胞 ，再将 重 重 组表达载体 DNA 分子 组表达载体 DNA 分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一 定的温度下促进感受态细胞吸收
8、 DNA 分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达 1.首先要检测 转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因， 方法是采用 DNA 分子杂交 DNA 分子杂交 技术技术。 2.其次还要检测 目的基因是否转录出了 mRNA目的基因是否转录出了 mRNA， 方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mR用标记的目的基因作探针与 mR NA 杂交NA 杂交。 3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质
9、目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质蛋白质，用相应的 抗体抗体进行抗原抗体杂交抗原抗体杂交。 4.有时还需进行 个体生物学水平 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 （三）基因工程的应用 1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。 3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。把正常的
10、外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 （四）蛋白质工程的概念 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因修饰或 基因合成基因合成，对现有蛋白质进行改造改造，或制造一种新的蛋白质新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需 求。 （基因工程在原则上只能生产自然界已存在自然界已存在的蛋白质） 转录 翻译转录 翻译 蛋白质工程的基本原理 ： 它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工 程。基本途径 ： 从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列， 找到相对应的脱氧核苷酸序列（基
11、因）以上是蛋白质工程特有的途径 ； 以下按照基因工程的 一般步骤进行。 （注意：目的基因只能用人工合成的方法） 专题 2 细胞工程专题 2 细胞工程 （一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）：细胞全能性细胞全能性 全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞植物细胞动物细胞 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织 愈伤组织 试管苗 植物体 （2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。 A 植物繁殖 微型繁殖：可
12、以高效快速地实现种苗的大量繁殖 作物脱毒：采用茎尖茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有植物分生区附近的病毒极少或没有） 人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装 得到的种子。 优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输 B 作物新品种培育 单倍体育种： a 过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab 四种类型） ；对花粉进行花 药离体培养（技术是植物组织培养）药离体培养（技术是植物组织培养） ；得到单倍体植株单倍体植株；对其
13、幼苗时期进行秋 水仙素 秋 水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb 四种类 型） 。 b 优点：明显缩短育种年限 C 突变体利用 ： 在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选 抗病、抗盐、含高蛋白的突变体 筛选 抗病、抗盐、含高蛋白的突变体） D 细胞产物的生产 ： 通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够 产生大量的细胞产物。 （3）地位：是培育转基因植物转基因植物、植物体细胞杂交植物体细胞杂交培育植物 新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程： （2）诱导融合的方法 ： 物理法包括离心
14、、振动、电刺激离心、振动、电刺激等。 化学法一般是用聚乙二醇（PEG）聚乙二醇（PEG） 作为诱导剂。 （3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。克服了远缘杂交不亲和的障碍。 （二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组组 织织，将它分散成单个细胞单个细胞，然后放在适宜的培养培养 基基中，让这些细胞生长和繁殖生长和繁殖。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞单个细胞制成细胞悬液细胞悬液转入培养瓶中进行原原 代代培养贴满
15、瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代传代 培养。 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁细胞贴壁。细胞 数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖停止分裂增殖，这 种现象称为细胞的接触抑制细胞的接触抑制。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 无菌、无毒的环境无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素抗生素， 以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积代谢产物积 累对细胞自身造成危害累对细胞自身造成危害。 营养营养：合成培养基成分：
16、糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血血 清、血浆清、血浆等天然成分。 温度温度：适宜温度：哺乳动物多是 36.50.536.50.5；pH：7.27.47.27.4。 气体环境气体环境：95%空气空气5%COCO2 2。O2是细胞代谢细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的 pH维持培养液的 pH。 （5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医 学研究的各种细胞。学研究的各种细胞。 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞体细胞核移植（比较难） 。 （2）选用去核卵(母)细胞卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，细胞质多， 营养丰富营养丰富。 （3）体细胞核移植的大致过程是：（右图）（右图） 高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期 的卵母细胞 减二分裂中期 的卵母细胞，去核（显微
