实时荧光定量PCR扫盲

《实时荧光定量PCR扫盲》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时荧光定量PCR扫盲（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1实时荧光定量 PCR 原理和实验无 论 是 对 遗 传 病 (如 地 中 海 贫 血 和 血 友 病 )、 传 染 病 (如 肝 炎 和 艾 滋 病 )或 肿 瘤 进 行 基 因 诊 断 ， 还 是研 究 药 物 对 基 因 表 达 水 平 的 影 响 ， 或 者 监 控 药 物 和 疗 法 的 治 疗 效 果 ， 定 量 PCR 技 术 都 可 以 发 挥很 大 作 用 。 定 量 PCR 技 术 的 最 新 进 展 是 实 时 荧 光 定 量 。 该 技 术 借 助 于 荧 光 信 号 来 检 测 PCR 产物 ， 一 方 面 提 高 了 灵 敏 度 ， 另 一 方 面 还 可 以 做

2、到 PCR 每 循 环 一 次 就 收 集 一 个 数 据 ， 建 立 实 时 扩 增曲 线 ， 准 确 地 确 定 CT 值 ， 从 而 根 据 CT 值 确 定 起 始 DNA 拷 贝 数 ， 做 到 了 真 正 意 义 上 的 DNA定 量 。 这 是 DNA 定 量 技 术 的 一 次 飞 跃 。 根 据 最 终 得 到 的 数 据 不 同 ， 定 量 PCR 可 以 分 为 相 对 定 量 和 绝 对 定 量 两 种 。 典 型 的 相 对 定 量如 比 较 经 过 不 同 方 式 处 理 的 两 个 样 本 中 基 因 表 达 水 平 的 高 低 变 化 ， 得 到 的 结 果 是

3、 百 分 比 ； 绝 对 定 量 则需 要 使 用 标 准 曲 线 确 定 样 本 中 基 因 的 拷 贝 数 或 浓 度 。 根 据 所 使 用 的 技 术 不 同 ， 荧 光 定 量 PCR又 可 以 分 为 TaqMan 探 针 和 SYBR Green I 荧 光 染 料 两 种 方 法 。 比 较 而 言 ， 探 针 杂 交 技 术 在 原 理 上更 为 严 格 ， 所 得 数 据 更 为 精 确 ； 荧 光 染 料 技 术 则 成 本 更 为 低 廉 ， 实 验 设 计 更 为 简 便 。 在 选 择 实 验 方 案时 要 根 据 实 验 目 的 和 对 数 据 精 度 的 要 求

4、 来 决 定 。 定 量 实 验 与 定 性 实 验 最 大 的 不 同 ， 是 要 考 虑 统 计 学 要 求 并 对 数 据 进 行 严 格 的 校 正 ， 以 消 除 偶 然 误差 。 因 此 重 复 实 验 和 设 立 内 对 照 非 常 重 要 。 由 于 各 种 各 样 的 客 观 原 因 ， 这 一 点 在 实 践 中 往 往 被 轻 视 或忽 视 ， 需 要 着 重 强 调 。 当 然 ， 与 定 性 实 验 一 样 ， 定 量 PCR 也 要 设 立 阴 性 和 阳 性 对 照 ， 以 监 控 试剂 和 实 验 操 作 方 面 可 能 出 现 的 问 题 。 1 为 什 么

5、终 点 定 量 不 准 确 ？ 我 们 都 知 道 理 论 上 PCR 是 一 个 指 数 增 长 的 过 程 ， 但 是 实 际 的 PCR 扩 增 曲 线 并 不 是 标 准 的 指数 曲 线 ， 而 是 S 形 曲 线 。 这 是 因 为 随 着 PCR 循 环 的 增 多 ， 扩 增 规 模 迅 速 增 大 ， Taq 酶 、dNTP、 引 物 ， 甚 至 DNA 模 板 等 各 种 PCR 要 素 逐 渐 不 敷 需 求 ， PCR 的 效 率 越 来 越 低 ， 产 物 增 长的 速 度 就 逐 渐 减 缓 。 当 所 有 的 Taq 酶 都 被 饱 和 以 后 ， PCR 就 进

6、 入 了 平 台 期 。 由 于 各 种 环 境 因 素 的复 杂 相 互 作 用 ， 不 同 的 PCR 反 应 体 系 进 入 平 台 期 的 时 机 和 平 台 期 的 高 低 都 有 很 大 变 化 ， 难 以 精 确控 制 。 所 以 ， 即 使 是 重 复 实 验 ， 各 种 条 件 基 本 一 致 ， 最 后 得 到 的 DNA 拷 贝 数 也 是 完 全 不 一 样 的 ，波 动 很 大 （ 图 1） 。 图 1 同 一 个 样 本 重 复 96 次 PCR 的 扩 增 曲 线传 统 的 定 量 方 法 ， 如 溴 乙 锭 染 色 或 放 射 性 核 素 掺 入 标 记 后 的

7、 光 密 度 扫 描 等 ， 测 定 的 都 是PCR 的 终 产 物 ， 而 不 是 起 始 DNA 拷 贝 数 。 由 于 PCR 的 终 产 物 量 与 起 始 模 板 量 之 间 没 有 线 性 关 系 ，所 以 根 据 最 终 的 PCR 产 物 量 不 能 计 算 出 起 始 DNA 拷 贝 数 。 对 于 绝 大 多 数 实 验 ， 比 如 甲 肝 的 诊 断 、 药 物 疗 效 的 监 测 等 ， 需 要 测 定 的 都 是 PCR 放 大 之前 标 本 中 的 DNA 原 始 拷 贝 数 ， 经 过 PCR 扩 增 以 后 的 DNA 拷 贝 数 已 经 不 能 反 映 真

8、实 情 况 。 在 这种 情 况 下 ， 就 不 能 采 用 终 点 定 量 ， 而 要 根 据 CT 值 确 定 DNA 起 始 拷 贝 的 数 量 。 2 为 什 么 CT 值 与 起 始 模 板 拷 贝 数 成 线 性 关 系 ？ CT 值 的 定 义 是 PCR 扩 增 过 程 中 ， 荧 光 信 号 开 始 由 本 底 进 入 指 数 增 长 阶 段 的 拐 点 所 对 应 的 循 环次 数 。 从 图 1 的 重 复 实 验 中 可 以 直 观 地 看 到 ， 尽 管 平 台 期 DNA 拷 贝 数 波 动 很 大 ， CT 值 却 是 相对 固 定 的 。 如 果 用 不 同 浓

9、 度 的 DNA 作 PCR， 可 以 看 出 DNA 浓 度 越 高 ， CT 值 越 小 。 DNA 浓度 每 增 加 1 倍 ， CT 值 减 小 1 个 循 环 。 CT 值 与 模 板 DNA 的 起 始 拷 贝 数 成 反 比 。 2这 一 结 论 可 以 从 数 学 上 严 格 证 明 。 为 使 表 达 式 简 便 ， 以 下 推 导 忽 略 PCR 效 率 等 细 节 。 如果 考 虑 这 些 因 素 ， 可 以 在 方 程 上 增 加 修 正 项 。 这 些 修 正 项 的 增 加 并 不 改 变 方 程 的 线 性 性 质 。 一 般 地 ， 我 们 有 Rn=RB+XO

10、(1+EX)nRS,也 就 是 说 第 n 次 PCR 循 环 时 的 荧 光 信 号 强 度 (Rn)等 于 背 景 信 号 强 度 (RB)加 上 每 个 分 子 的 荧 光 强 度 (即 单 位 荧 光 强 度 ， RS)与 分 子 数 目 的 乘 积 。 当循 环 次 数 n = CT 时 ， 则 有 RT=RB+XO(1+EX)CTRS。 两 边 取 对 数 ， 得 log(RT -RB) = logX0 + CTlog(1+ Ex) + logRs。 整 理 此 式 ， CTlog(1+ Ex) = - logX0 + log(RT -RB)logRs。 所 以 对 于 每 一 个

11、 特 定 的 PCR 反 应 来 说 ， EX、 RT、 RB 和 RS 都 是 常 数 ， 所 以 CT 值 与 log X0 成 反 比 ， 也 就 是 说 ， CT 值 与 起 始 模 板 拷 贝 数 (X0)的 对 数 成 反 比 ， 起 始 DNA 浓 度 每 增 加 1倍 ， CT 值 减 小 1 个 循 环 。 根 据 CT 值 的 定 量 是 精 确 和 严 格 的 ， 而 传 统 的 终 点 定 量 则 比 较 粗 放 。 如 果 读 者 有 兴 趣 的 话 ， 也 可 以 假 设 PCR 的 效 率 (即 Ex)为 100%， 从 上 式 推 算 出 定 量 PCR标 准

12、曲 线 的 最 佳 斜 率 和 CT 值 的 最 佳 范 围 。 3 怎 样 确 定 CT 值 ？ 实 验 操 作 中 ， CT 值 定 义 为 在 基 线 上 方 产 生 可 检 测 到 的 统 计 学 上 显 著 的 荧 光 发 射 时 所 对 应 的 PCR循 环 次 数 （ 图 2） 。 “基 线 上 方 ”也 就 是 阈 值 高 度 的 量 化 定 义 是 基 线 范 围 内 荧 光 信 号 强 度 标 准 偏 差 的10 倍 。 阈 值 所 在 的 横 线 与 PCR 扩 增 曲 线 的 交 点 所 指 的 PCR 循 环 次 数 就 是 CT 值 。 基 线 范 围 的定 义 是

13、 从 第 3 个 循 环 起 到 CT 值 前 3 个 循 环 止 ， 其 终 点 要 根 据 每 次 实 验 的 具 体 数 据 调 整 ， 一 般 取 第3 到 第 15 个 循 环 之 间 。 早 于 3 个 循 环 时 ， 荧 光 信 号 很 弱 ， 扣 除 背 景 后 的 校 正 信 号 往 往 波 动 比 较 大 ，不 是 真 正 的 基 线 高 度 ； 而 在 CT 值 前 3 个 循 环 之 内 ， 大 多 数 情 况 下 荧 光 信 号 已 经 开 始 增 强 ， 超 过 了基 线 高 度 ， 都 不 宜 当 作 基 线 来 处 理 。 图 2CT 值 和 阈 值显 然 ，

14、CT 值 取 决 于 阈 值 ， 阈 值 取 决 于 基 线 ， 基 线 取 决 于 实 验 的 质 量 ， CT 值 是 一 个 完 全客 观 的 参 数 。 CT 值 越 小 ， 模 板 DNA 的 起 始 拷 贝 数 越 多 ； CT 值 越 大 ， 模 板 DNA 的 起 始 拷 贝 数越 少 。 正 常 的 CT 值 范 围 在 18-30 之 间 ， 过 大 和 过 小 都 将 影 响 实 验 数 据 的 精 度 。 4 荧 光 信 号 和 定 量 数 据 的 归 一 化 虽 然 大 多 数 定 量 PCR 仪 都 会 自 动 扣 除 本 底 ， 但 是 仍 然 需 要 注 意 荧

15、 光 信 号 强 度 和 定 量 数 据 的 归 一化 校 正 ， 以 便 不 同 样 本 之 间 的 实 验 数 据 可 以 严 格 地 相 互 比 较 。 由 于 加 样 操 作 的 误 差 、 离 心 管 透 光 性 能 的 差 异 、 荧 光 激 发 效 率 的 差 异 等 偶 然 误 差 不 可 避 免 ， 因 此仪 器 收 集 到 的 原 始 信 号 必 须 进 行 归 一 化 校 正 ， 以 消 除 这 些 因 素 对 定 量 结 果 的 影 响 。 这 种 校 正 可 以 通 过在 反 应 体 系 中 添 加 额 外 的 荧 光 染 料 来 实 现 ， 一 般 采 用 红 色

16、ROX 荧 光 ， 称 为 阳 性 参 比 信 号 。ROX 在 反 应 缓 冲 液 中 的 浓 度 是 固 定 的 ， 因 此 其 信 号 的 强 度 与 反 应 体 系 的 总 体 积 和 总 的 荧 光 激 发 效 率正 相 关 。 目 标 基 因 和 对 照 基 因 的 信 号 除 以 阳 性 参 比 信 号 以 后 ， 即 Rn = R / RROX， 就 可 以 在 同3样 的 起 点 上 进 行 比 较 和 各 种 计 算 。 ROX 校 正 可 以 提 高 定 量 数 据 的 精 度 和 重 现 性 ， 减 少 孔 间 差 异 （ 图 3） 。 图 3 ROX 荧 光 校 正 （ 左 ） 和 不 校 正 （ 右 ） 对 实 验 数 据 的 影 响 归 一 后 的 荧 光 信 号 再 扣 除 本 底 ， 就 得 到 DRn： DRn = Rn,样 本 - Rn,空 白 。 DRn 是 最 后 构 建PCR 实 时 扩 增 曲 线 的 纵 坐 标 。 无 论 绝 对 定 量 还 是 相 对 定 量 ，