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1、自身免疫性疾病相关检测,Qingmao Geng,自体免疫性疾病（Autoimmune disease），亦作自体免疫问题，是一种人体内自己的免疫系统攻击自己身体正常细胞/组织/器官的疾病，就是正常的免疫能力下降，而异常的免疫能力却突显的一种问题。 自身免疫病的特点： 多数病因不明，常呈自发性或特发性； 多数病程较长，多呈反复发作和慢性迁延过程； 某些具有遗传倾向； 多数疾病女性多于男性； 多数患者血清中可以检测到抗核抗体或其它自身抗体；,自身免疫性疾病,分类：系统性，组织器官特异性。 目前主要的疾病包括：,主 要 疾 病,涉及的科室：风湿免疫科、皮肤科、呼吸内科、血液科、肾内科、消化科、骨科
2、、保健科、神经内科等。,传统定义：针对细胞核成分的自身抗体的总称。 广义定义：针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA 的理解不再局限于核成分，而是指核酸和核蛋白抗体的总称 ANA的靶抗原分布： 细胞核 整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。 ENA：抗可提取核抗原，包括RNP/Sm, Sm, SSA, SSB, Scl-70和Jo-1等 六种靶抗 原,抗核抗体的定义,抗核抗体主要检测方法,间接免疫荧光法：最经典，金标准！ 酶联免疫吸附试验（ELISA）：可定量 免疫印迹法（WB）：特异性非常好 线性酶免：兼顾特异性、敏感度 放射免疫法：灵敏度好,抗核抗体的主要检
3、测方法,美国风湿学会(ACR)立场声明,HEp-2 细胞包含大约100 至150 种自身抗原 其它初筛方法仅具有少量自身抗原 (8-10),大约 35% SLE患者和IFT-ANA阳性患者在其它初筛实验中为阴性结果,建议： IFT-ANA仍然为ANA检测的金标准!,ANA检测间接免疫荧光法(IFT), 抗原谱完整 (细胞核、细胞浆) 检测ANA的金标准，具有很高的敏感性和特异性 基质组合: HEp-2细胞+灵长类肝,根据产生的荧光模型、靶抗原的分布分类如下：,ANA,核均质型：DNA、组蛋白和核小体等,核膜型：板层素、gp210等,核颗粒型,核仁型：Scl-70、RNA多聚酶、PM-Scl和原
4、纤维蛋白等,核浆点型：着丝点、核点等,胞浆颗粒型：线粒体、Jo-1、核糖体等,胞浆纤维型：波形蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白等,分裂期细胞阳性：纺垂体、中间体、中心粒等,核糖核蛋白：Sm、nRNP、SS-A、SS-B,细胞核,细胞浆,Ku,细胞周期蛋白：I型（PCNA）和II型,抗核抗体荧光结果,荧光结果滴度的解读,SLE诊断标准（ACR2009年修订）,ANA检测的临床意义,系统性红斑狼疮 活动期 非活动期 药物诱导的红斑狼疮 混合性结缔组织病（MCTD、Sharp综合征） 类风湿性关节炎 进行性系统性硬化症 多发性肌炎及皮肌炎 干燥综合征 慢性活动性肝炎 溃疡性结肠炎 其它风湿病 正常人,95
5、100 80100 100 100 2040 2050 8595 3050 7080 3040 26 5-10,抗核抗体谱项目介绍,欧蒙印迹法 实验原理,实验原理 将抗原包被在固相膜片上，然后将膜片固定在合成膜条上。 若样本阳性，血清/浆中的特异性抗体与固相上的抗原结合。 结合的抗体与碱性磷酸酶标记的抗人抗体结果。 加入色原/底物液产生颜色反应。 依据所包被的抗原，可在相同条件下同时检测多种抗体。,ANA-3G 检测项目,ANA-3G各项自身抗体的临床意义,SLE,SjS,Scl,MCTD,PBC,PM/DM,话题: ANA全抗原检测与特异性检测,全抗原检测与特异性检测,HEp-2 cells
6、 + primate liver,+,ANA profile 3G,协和医院的临床研究,协和医院的临床研究,SSA and/or Ro52+ (n=11), Histone+ (n=1), Scl-70+ (n=1), Jo-1+ (n=1), M2+ (n=1),协和医院的临床研究,最新研究,IFT为阴性时，LIA的符合率为74.8% LIA为阳性时，IFT的符合率为81.1%,最新研究,IFT为阴性，而LIA为阳性的206例患者中,最新研究,原文中的讨论,最新研究,最终的结论,ACR的申明,荧光阳性而靶抗原阴性,如果所有的已知靶抗原都是阴性，那做荧光检测的意义是什么？,案例分析,47岁的中
7、年妇女，临床症状提示可能SLE，但ANA靶抗原检测全部阴性。 由于受到血清学检测结果的干扰，最终得出的诊断为皮肤结节性多动脉炎 专家提出质疑，要求用IFT方法重新检测ANA，发现为强阳性。 根据ANA-IFT的阳性结果，最终修正结果为SLE，由于正确的诊断，患者得到了良好的治疗 结论：不明靶抗原的ANA荧光阳性，是具有诊断意义的。,案例分析,SLE诊断标准（ACR2009年修订）,慢性炎症性结缔组织病 (CICTD),慢性炎症性结缔组织病 (CICTD),Systemischer Lupus Erythematodes (SLE),干燥综合征 (SS),系统性硬化症 (SSc),Rheumat
8、oide Arthritis (RA),多肌炎/皮肌炎 (PM/DM),类风湿性关节炎 (RA),系统性红斑狼疮 (SLE),ANCA 相关性血管炎,MPO and PR3,慢性炎症性结缔组织病 (CICTD),慢性炎症性结缔组织病 (CICTD),Systemischer Lupus Erythematodes (SLE),干燥综合征 (SS),系统性硬化症 (SSc),Rheumatoide Arthritis (RA),多肌炎/皮肌炎 (PM/DM),类风湿性关节炎 (RA),系统性红斑狼疮 (SLE),ANCA 相关性血管炎,MPO and PR3,侵犯皮肤和多脏器的一种全身性自身免疫
9、病。 某些不明病因诱导机体产生多种自身抗体(如抗核抗体等)，导致： 自身抗体与相应自身抗原结合为循环免疫复合物，通过III型超敏反应而损伤自身组织和器官； 抗血细胞自身抗体与血细胞表面抗原结合，通过II型超敏反应而损伤血细胞。,系统性红斑狼疮（SLE）,临床发病特点 发病率: 40/100,000(北欧);200/100,000(非洲);250,000 (美国) 患者寿命:4年/50%(1950); 15/80%(当前); 20岁诊断/35岁死亡几率1:6,SLE 各器官的表现,关于SLE的诊断经历了很长时间，其标准也不断修正和完善，基本上存在4个标准：,SLE标准,颊部红斑：固定红斑，扁平或
10、高起，在两颧突出部位，不累及鼻唇沟。 盘状红斑：片状高起的红斑，粘附有角质脱屑和毛囊栓，老的病变可发生萎缩性瘢痕。 光过敏：对日光有不寻常的反应引起皮疹，从病史得知或医生观察到。 口腔溃疡：经医生观察到的口腔或鼻咽部溃疡，一般无痛性。 关节炎：非糜烂性关节炎，累及2个或更多的外周关节，特征为压痛、肿胀、积液。 浆膜炎： a、胸膜炎明确的胸膜炎性疼痛史，经医生听到摩擦音或有胸腔积液。 b、心包炎心电图（ECG）记录，或心包摩擦音，或心包积液的证据。,1982年标准,肾脏病变： a、持续性蛋白尿，尿蛋白的定量每日超过0.5g或定性实验 + + +。 b、细胞管型，可为红细胞、血红蛋白、颗粒管型等或
11、混合性。 神经病变： a、癫痫没有诱发药物或已知的代谢紊乱，如尿毒症、酮症酸中毒或电解质紊乱。 b、精神病没有药物影响或已知的代谢紊乱，如尿毒症、酮症酸中毒或电解质紊乱。 血液学改变： a、溶血性贫血伴有网织红细胞增多。 b、白细胞减少2次或多次低于4.0109/L。 c、淋巴细胞减少2次或多次低于1.5109/L。 d、血小板减少在没有药物影响下低于100109/L。,1982年标准,免疫学异常： a、阳性LE细胞反应。 b、抗DNA抗体和抗天然DNA抗体滴度异常。 c、抗Sm抗体阳性，存在抗Sm核抗原的抗体。 d、假阳性梅毒血清试验，至少持续6个月，并经梅毒螺旋体固定试验或荧光螺旋抗体吸收
12、试验证实。 抗核抗体： 在任何恰当时间和在没有用药诱发“药物性狼疮”综合征的情况下，免疫荧光或其它相应的试验检测出抗核抗体滴度的改变。 用于临床研究鉴别病人，在任何观察期间，如上述11条标准中有4条以上同时出现，可以认为病人有系统性红斑狼疮。,1982年标准,临床标准 急性或亚急性皮肤狼疮表现； 慢性皮肤狼疮表现； 口腔或鼻咽部溃疡； 脱发 炎性滑膜炎，有2个外周关节肿痛或压痛伴晨僵； 浆膜炎； 肾脏病变：尿蛋白0.5g/24h，或有RBC管型； 神经病变：癫痫发作或精神失常，多发性单神经炎，脊髓炎，外周或颅神经病变，脑炎 溶血性贫血 WBC 4 X 109/L至少一次，或淋巴细胞 1 X 1
13、09/L至少一次； 血小板100 X 109/L至少一次。,2009年标准,免疫学诊断标准 ANA滴度高于正常值； 抗dsDNA高于参考值； 抗Sm抗体; 抗磷脂抗体阳性，即狼疮抗凝物阳性，梅毒血清学试验假阳性，抗心磷脂抗体水平升高； 补体降低，包括C3、C4和CH50； 直接抗人球蛋白（Combs）实验阳性（非溶血性贫血状态）。,2009年标准,确诊条件： 肾活检证实为LN（免疫荧光技术）：肾小球基底膜广泛的Ig、C3、C4、C1q沉积“满堂亮” 满足以上4条标准（包括至少一条临床标准和至少一条免疫学标准） 与以前标准的差别： 明确分为两类标准：临床标准和免疫学标准 增加了自身抗体的种类和比
14、重,2009年标准,SLE相关自身抗体,高特异性抗体,核均质型HEp-2-Cells/Primate liver,EUROIMMUN,- 检测方法: IIFT, Farr-法 (RIA), ELISA or Blot,抗dsDNA 自身抗体,高度特异性抗体 70%患者阳性 滴度与疾病活动性相关 抗体滴度上升但临床症状不明显的患者，抗体检测后5年内80%患者进入活动期,抗dsDNA抗体与SLE,用两种或两种以上的方法进行检测！,靶抗原：dsDNA-组蛋白-复合物的构象决定簇 方法：IIFA、ELISA、Blot 临床意义：SLE，阳性率5095%；特异性：接近100%,抗核小体抗体与SLE,AN
15、uA与疾病的活动性相关性强（SLEDAI score） Su et al., ClinImmunol122: 115-120, 2007,抗核小体抗体与SLE,抗核小体抗体与SLE,抗核小体抗体与狼疮性肾炎,LNTP = lupus nephritis requiring renal transplantation LN = biopsy proven lupus nephritis CON = SLE patients without nephritis,狼疮肾炎是SLE的一种潜在的严重并发症 (高达 50%) 1.2% 需要进行肾移植的患者有狼疮肾炎,伴有狼疮肾炎的严重SLE的生物标记物,
16、Stinton et al., Lupus 15: 394-400, 2007,U1-nRNP and Sm,Anti-Sm,Anti-U1 RNP,MCTD: 95-100% SLE: 15-40%,SLE: 530%,Anti-Sm and SLE,Elizabeth Benito-Garcia et al., Arthritis Care 1979),抗核周因子 (APF; 1964),靶抗原: 丝集蛋白,靶抗原: 前丝集蛋白,丝集蛋白,丝集蛋白 =上皮细胞表达的蛋白质, 连接角蛋白纤维. 前体: 前丝集蛋白,将精氨酸替换为瓜氨酸,CCP环瓜氨酸肽,- 瓜氨酸肽：线状还是环状?, CCP = Cyclic Citrullinated Peptide（环瓜氨酸肽）,抗RA相关角蛋白抗体,靶抗原：食管表皮中丝集蛋白和前丝集蛋白相关蛋白 基质：大鼠食道 相关疾病：类风湿关节炎早期诊断指标，特异性95%，敏感性30-45%。与疾病活动性及
