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1、.,1,小鼠基因敲除,相关问题简介,.,2,CONTENTS,基因敲除技术原理简介,1,基因敲除小鼠的基因型鉴定,2,基因敲除小鼠的饲养和繁殖,3,.,3,基因敲除技术原理简介,一、,.,4,1.基因敲除技术简介,基因敲除小鼠技术 (knock-out mouse technology )是指 通过基因工程的方法使小鼠体内某种基因功能缺失的生物 学技术。 传统的基因敲除方法有： 插入突变法 同源重组法 RNA干扰(RNA interference,RNAi)法 目前在同源重组法的基础上改良的基因敲除技术有： 借助Cre-loxp系统的条件型基因敲除法 CRISPRCas9 技术,（棕褐色AA）
2、,（白色）,（Aa）,（Aa）,(AA),(AA),（Aa）,（Aa）,(aa),.,5,2.基因敲除技术步骤,2.1 胚胎干细胞的分离培养 2.1.1 首先将129小鼠胚胎分离培养，待胚胎周围逐渐形成ES细胞集落。 2.1.2 然后将ES细胞集落从培养的胚胎周围分离。进行一段时间的培养后将ES细胞集落吸出分散成单个的细胞，将这些单细胞分离出来进行常规培养。 2.1.3 最后对分离培养的ES细胞进行鉴定。（它应该具有正常的二倍体核型及体内外分化能力）,鉴定方法,把这种胚胎移植到雌性假孕鼠的子宫内，是否形成“ 嵌合体 ”胚胎 。,将ES细胞注入到同种或免疫缺陷性小鼠的皮下、睾丸或肾包囊，观察注入
3、的细 胞在宿主动物体内是否形成畸胎瘤。,把受试细胞在体外进行随机自发的分化或诱导它们向不同胚层的细胞分化。一般 的方法是去除饲养层细胞后，ES细胞聚集并形成类胚体 。,.,6,2.基因敲除技术步骤,2.2 构建基因打靶载体 根据需敲除的基因序列的特点设计的含有2个标记筛选基因和特定基因同源臂序列的靶向载体。以敲除小鼠Fam172a基因为例：,靶向载体,Fam172a,同源序列,靶基因,.,7,2.基因敲除技术步骤,2.3 同源重组 2.3.1 将打靶载体导入129小鼠ES细胞：目前常用的方法有显微注射法和电穿孔法。 2.3.2 同源重组筛选：由于哺乳动物细胞中基因随机整合的机率要远大于同源重组
4、，因此需要利用选择性标记基因将发生同源重 组的细胞筛选出来， 目前常用的筛选方法有正负双向选择法。,.,8,正负双向选择法,neo:正向选择基因。具有新霉 素(G418)抗性，其在发生随机 组合和同源重组的细胞中都可 以表达。 HSV-tk：负向选择基因。在发 生同源重组时别剪切掉，发生 随机组合时被保留。tk基因可 使无毒的丙氧鸟苷（GANC） 转化为毒性核苷酸而杀死细胞。,neo基因保留，tk基因被切除,对G418和GANC都有抗性,对G418有抗性，对GANC敏感,neo、tk基因均被保留,靶向载体,筛选出中靶ES,.,9,2.基因敲除技术步骤,2.4 基因敲除小鼠的产生 2.4.1 将
5、中靶的ES细胞注入到BALB/c小鼠囊胚，接种到新的培养皿中进行培养。 2.4.2 将正常发育含ES细胞的囊胚移植入受体小鼠子宫内 2.4.3 嵌合体小鼠的鉴别：通过观察小鼠被毛的颜色就可确定嵌合体小鼠。 2.4.4 基因敲除小鼠的制备：因为在同源重组过程中，ES细胞的2条染色体中一般只有1条进行重组，得到嵌合 体小鼠后，还要经过至少2代的繁育过程才能得到基因敲除小鼠。,.,10,基因敲除小鼠的基因型鉴定,二、,.,11,1.利用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定,1.1 提取小鼠尾部DNA组织 1.2 PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型 1.2.1 针对不同的Fam172a+/-，Fam172a-
6、/-，WT设计不同的引物 1.2.2 采用PCR仪进行扩增：变性退火延伸 1.2.3 取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 1.2.4 根据凝胶成像仪中的条带鉴别基因型 可能的结果分析 Fam172a+/-出现两条带，Fam172a-/-只出现一条带，WT出现一条带，但Fam172a-/-和WT出现的位置不 同。,.,12,2.利用WB测定组织中FAM172a蛋白水平,2.1 提取小鼠尾部组织蛋白 2.2 BCA法检测蛋白浓度 2.3 WB分析可能出现的结果： WT小鼠的条带灰度最高； Fam172a+/-条带的灰度值其次； Fam172a-/-无条带出现。,.,13,基因敲除小鼠的饲养与繁殖,
7、三、,.,14,1.饲养,基因鼠属SPF级别动物（指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，但非特定的微生物和寄生虫是容许存在的。一般指无传染病的健康动物，是目前国外使用最广泛的实验动物）它的来源，既可来自无菌动物繁育的后裔，亦可经剖胎取后，在隔离屏障设施的环境中，由SPF亲代动物抚育。 小鼠的房舍：最好选择能耐药液冲冼、隔音性强、无害虫栖息的地方，面积不宜过大。 垫料：应选择吸湿性好的（如锯木屑） 屏障温度：2025 湿度：4070 照明时间：每天明暗循环12小时。 小鼠鼠笼、饲料、垫料和饮水均经高温高压消毒灭菌处理来预防微生物感染，小鼠自由摄食饮水，垫料每周定期更换3次。 幼鼠由母鼠母乳喂
8、养，产后18-22天离乳，雌雄分笼。,.,15,2.繁殖,留种：一般选择同胎产仔10只以上 、发育良好、均匀、无死亡，适当延长哺乳期至 18一22天 , 体重在18克 以上者留种。选出的同胎仔鼠将公母分开 , 放入消毒好的鼠笼内 , 每笼 3一 5只 , 切记做好标记 , 待第一次换窝时再进行复选 , 按1:1的 比例进行选留 , 辨别雌雄 , 淘汰多余仔鼠。 如此重复两三次 ,效果更佳 , 一方面提高种鼠质量 , 另方面可防公母混杂 , 造成早配 , 影响繁殖率。 配种 严格控制动物房的灯光：早6到晚6保持照明，晚6到早6保持黑暗，这种光照对对小鼠的配种率极为重要。 尽量不要用嵌合体自交，应
9、选用杂合体进行交配繁殖。 由于小鼠夜间活动力强 , 正常的交配发生于夜晚 , 故可选 3月龄以上、1年以内的母鼠于傍晚前放入公鼠笼内合笼。 育种 适当增加饲料营养成分，如葵花籽、麦芽等。一个月龄以上的育种公鼠不宜再添加软料和葵花籽 ， 防止过肥 ，影响配种。 疾病预防：定期更换垫料，对鼠笼，饲料和饮水均需定期高温灭菌消毒。如育种过程中在同笼中发现患有传染病鼠即全笼淘汰 , 甚至发现有健康不良者或逃出笼外 , 其它鼠也最好淘汰 , 这种动物不宜用于繁殖。,.,16,T,H,A,N,K,13593891929,-,感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！,
