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1、,外源基因在宿主细胞中表达,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中 表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,克隆基因的表达：,原核生物基因表达系统,真核生物基因表达系统,大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统,酵母表达系统 丝状真菌表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统 植物生物反应器,常见表达系统的类型,用原核生物作宿主,A dividing E. coli,第一节 外源基因在原核细胞中的表达,原核或噬菌体启动子,MCS,SD序列,终止子,识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。,很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进
2、行转录的控制。,一、原核生物基因表达的特点,2. 以操纵子为单位,1. 只有一种RNA聚合酶,3. 转录和翻译偶联、连续进行。,4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统,5. 调控主要在转录水平上,位于mRNA的起始密码AUG的上游510个碱基处，同核糖体16S rRNA3末端序列互补，帮助从起始AUG处开始翻译 。,6. mRNA的核糖体结合位点上，含有SD序列,Shine-Dalgarno（SD）sequence:,1. 外源基因不能带有内含子,2. 一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA,3. 必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调控元件控制外源基因的表达,4. 利用宿主细胞的调控
3、系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害,为何？,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,大肠杆菌基因表达载体基本结构特征,是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。,1. 启动子,-35 Box 和 -10 Box,2. 核糖体结合位点（ RBS）,Shine-Dalgarno（SD） sequence,翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3端相互作用，正确定位起始密码子,SD,5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA,SD序列距离AUG的距
4、离影响翻译,3. 转录终止子,在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子，mRNA转录终止信号。,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,包涵体（inclusion body）,是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。,1. 细胞质中表达,在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone, hGH）。,例：,使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞,回收的蛋白生物活性差。, 优点,缺点,周质（periplasm）,革兰氏阴性菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,优点：,2. 周质中表达,容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,由于需
5、要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。,用溶血素基因构建分泌性融合蛋白,使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。,或与细菌素释放蛋白共表达,3. 胞外表达,（1）一致顺序,1. 启动子的结构对表达效率的影响,五、影响外源基因表达效率的因素,-35 Box 和 -10 Box,（2）-35区与-10区之间的距离,间隔为17bp时，启动子最强。,（3）-35区和-10区的碱基顺序,越接近一致顺序，启动子越强。,5-TTGACA,TATAAT,一致顺序,lac,trp,PL,recA,tac I,tac II,5-TTTACA,TATGTT,5-TTG
6、ACA,TTAACT,5-TTGACA,GATACT,5-TTGATA,TATAAT,5-TTGACA,TATAAT,5-TTGACA,TTTAAT,-35box,-10box,（1）SD序列,2. 翻译起始序列对表达效率的影响,翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3端相互作用，正确定位起始密码子,SD,5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA, SD序列距离AUG的距离影响翻译,5-UAAGGAGG-3,如果是A（T），翻译效率最高； 如果是G（C），效率只有50%或25%。, mRNA-rRNA互补区域长短影响基因的翻译,5-AGGAGGU-3,？,5-AAGGA-3,
7、SD序列后面的4个碱基,AUG左侧的三个碱基也有影响,（2）起始密码AUG,AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；,AUG右侧的三个碱基也有影响。,-半乳糖苷酶的mRNA中：,是UUC、UCA或AGG时下降20倍。,3. 启动子与外源基因之间的距离,转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费资源和能量、不会干扰正常表达。,增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。,4. 转录终止区对表达效率的影响,5. 载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响,6. 外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响,但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长,转录水平的优化,（1）使用强启动
8、子或诱导型启动子 （2）强终止子，或将两个终止子串联 （3）提高mRNA的稳定性 如：在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列,六、提高表达水平常用的方法,2. 翻译水平的优化,（1）优化翻译起始区 起始密码子ATG mRNA-rRNA互补区域长短， SD序列距离AUG的距离，及碱基种类 翻译增强子,（2）翻译的终止 三个终止密码子，防止核糖体跳跃 终止密码子后的核苷酸类型，如UAAU为大肠杆菌最有效的翻译终止序列。,（3）密码子的选择 受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因 将稀有密码子改为偏爱密码子,（1）表达分泌蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”：蛋白质从细胞质跨过
9、内外膜到培养液中。 “分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。,3. 提高目的产物稳定性,防止被宿主的酶降解。, 使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。,（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解,减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。,（1）强启动子提高转录效率； （2）使用高拷贝表达载体。,4. 质粒的拷贝数,增加mRNA数量， 提高核糖体与mRNA的结合速度,（1）培养基 （2）环境因素 （3）诱导时间和剂量,5. 宿主菌的选择,表达载体与宿主相
10、互匹配,6. 培养条件优化,1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。,2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在，必须经过变性、复性处理才能获得有生物活性的蛋白，并且其表达量非常低。,七、原核细胞表达的缺陷,4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。,5、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难以排除，污染表达产物，影响产品纯度。,3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶降解。,七、原核细胞表达的缺陷,1. 胰岛素的结构及其生物合成,2. 人胰岛素的生产方法,3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,七、利用重组大肠杆菌生
11、产人胰岛素,1. 胰岛素的结构及其生物合成,S,S,S,S,C,N,S,S,B 肽（30）,C 肽（31）,A 肽（21）,R,R,R,K,S,S,S,S,C,N,S,S,N,C,高尔基体内的特异性肽酶,N,C,信号肽,B 肽,C 肽,A 肽,信号肽酶,2. 人胰岛素的生产方法,（1）直接提取法制人胰岛素,迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：,早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。,（2）化学合成法制人胰岛素,根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产
12、成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。,2. 人胰岛素的生产方法,迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：,（3）化学转型法制人胰岛素,猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。,2. 人胰岛素的生产方法,迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：,2. 人胰岛素的生产方法,迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：,上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下
13、来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。,（3）化学转型法制人胰岛素,2. 人胰岛素的生产方法,迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：,1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。,（4）基因工程法制人胰岛素,上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外 胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任
14、何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。,2. 人胰岛素的生产方法,迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：,（4）基因工程法制人胰岛素,3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,（1）A链和B链分别表达法,化学合成: A、B链的编码序列,表达产物的后处理路线：,（1）A链和B链分别表达法,生产技术的评价：,由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生
15、产重组人胰岛素的工艺路线。,（1）A链和B链分别表达法,（2）人胰岛素原表达法,3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,（2）人胰岛素原表达法,表达产物的后处理路线：,二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。 目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。,（2）人胰岛素原表达法,生产技术的评价：,（3）A链和B链同时表达法,3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,（4）分泌型重组人胰岛素表达法,上述三
16、种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式存在于胞质中。,3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略，是将胰岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。,（4）分泌型重组人胰岛素表达法,3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,第二节 外源基因在真核细胞中的表达,酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。,真核或病毒启动子,MCS,PolyA信号,终止子,外源基因,一、真核生物表达的优越性和必要性,1、真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基
