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1、重组DNA技术 Recombinant DNA Technology,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工 程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1985年 K.Mullis的聚合酶链式反应技术 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,第 一 节重组DNA技术概述 Overview of Recombinant
2、 DNA Technology,一、重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆,克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一） “克隆”就是获得遗传背景完全相同的分子或个体的“拷贝”,技术水平：分子克隆(molecular cloning) 即DNA 克隆 生殖性克隆(动物克隆) 治疗性克隆,DNA克隆(DNA cloning) 通过一系列操作在体外获得大量相同DNA分子的技术，也称分子克隆(molecular cloning)或重组DNA技术 (recombinant DNA technology) 。,（二） 分子
3、(DNA)克隆可以产生大量相同的DNA分子,利用分子克隆手段, 可以获得大量相同的DNA分子,这主要基于DNA分子能构建到克隆载体中形成重组DNA分子, 并在宿主细胞中复制, 通过这种方式, 重组DNA被扩增。,二、重组DNA技术是在体外利用酶对DNA进行重组的操作,重组DNA技术(recombinant DNA technology), 即在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的遗传元件(又称载体)中, 形成重组的DNA分子, 并在宿主细胞中增殖。这种复制基因或DNA片段以产生相同DNA分子“拷贝”的技术，称为重组DNA技术或DNA克隆。又称分子克隆、基因克隆、基因
4、工程或遗传工程。,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,目 录,第 二 节重组DNA技术常用分子工具 Molecular Tools in Recombinant DNA Technology,一、工具酶在重组DNA技术中具有特殊的用途,限制性内切核酸酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,目 录,（一） 限制性内切核酸酶是重组DNA重要的工具酶,定义: 限制性内切核酸酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切
5、酶。,GGATCC CCTAGG,G CCTAG,GATCC G,+,Bam H,作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类 、 （基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,属 系 株 序,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,GGATCC CCTAGG,Bam H,GTC CAG,G CCTAG,
6、GATCC G,+,GGATCC CCTAGG,Hind,GTCGAC CAGCTG,GAC CTG,+,平端切口,粘端切口,同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,GGATCC CCTAGG,G CCTAG,GATCC G,+,Bam H,GGATCC CCTAGG,G CCTAG,GATCC G,+,Bst,同尾酶（isocaudarner） 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,GGATCC CCTAGG,AGAT
7、CT TCTAGA,G CCTAG,GATCC G,+,+,A TCTAG,GATCT A,（二）连接酶可将具有配伍末端的DNA片段共价连接,连接酶的作用机制,（三）构建重组DNA分子还需要其他工具酶,碱性磷酸酶能去除DNA分子的5-磷酸基 DNA聚合酶和核酸外切酶用于修剪限制性片段的末端 脱氧核苷末端转移酶用于DNA分子加尾以构成粘性末端,将粘性末端转变成钝性末端,3,对5-粘性末端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3OH端延伸，可填平末端的凹陷并将其转变成钝性末端。,将粘性末端转变成钝性末端,C T G C A,C,G,3,对3粘性末端的片段，应用如T4 DNA聚合酶的
8、35的核酸外切酶活性可切去未配对的序列，将其转变成钝性末端。,核酸外切酶,3,5,3,5,5,3,3,5,3OH,GGG,GG,dGTP,末端转移酶,末端转移酶加尾,二、克隆载体可容纳外源DNA且具有自我复制能力,载体： 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准,能自主复制；
9、 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 应有高的拷贝数。,1. 质粒 (plasmid),特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,目 录,pBR322的物理图谱,目 录,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,2. 噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,3. 粘性质粒(cosmid),酵母人工染色体 (yeast artificial chromo
10、some, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,三、宿主细胞为重组的DNA分子提供扩增 、筛选和表达的场所,宿主细胞（host cells）是重组分子进行繁殖的场所。理想的宿主细胞通常是DNA或蛋白质降解系统缺陷株或重组酶缺陷株，因而具有较强地接纳外源DNA的能力，保证外源DNA能长期、稳定地遗传或表达。,第 三 节DNA 克 隆 DNA Cloning,重组DNA技术基本原理,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,目 录,一、DNA克隆的
11、核心过程是构建重组DNA分子,（一）构建重组载体产生DNA杂合分子,1. 根据目的选择适宜的克隆策略 2. 通过限制性内切酶水解载体及外源片段产生配伍末端 （1）限制酶水解载体使成为线性分子 （2）根据目的选择外源DNA的来源 （3）限制性内切酶水解外源DNA片段以产生与载体配伍的末端,3DNA连接酶将载体 DNA与外源DNA连接,(1) 粘端连接 (2) 平端连接 (3) 同聚物加尾连接 (4) 人工接头(linker)连接,同一限制酶切位点(单酶切)连接,不同限制酶切位点(双酶切)的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目 录,平端连接
12、 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端,目的基因,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA连接酶 15,目 录,同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,目 录,（二）重组分子可通过扩增、筛选与分离鉴定而获得,1. 将重组DNA导入宿主细胞有转化、转染和感染几种方法 将外源DNA转入细菌的过程称转化(transformation) 将外源 DNA直接
13、转入动物细胞的过程称转染 (transfection) 采用包装病毒将外源DNA转入细胞的过程称感染 (infection),2标志筛选和序列分析可用于重组子的筛选和鉴定,（1）质粒的抗性基因是转化菌的筛选标志 （2）用插入失活筛选重组子 （3）标志补救(marker rescue)是筛选转化酵母的常用方法 （4）限制性图谱和核酸序列分析可直接鉴定外源 DNA,(插入失活法) 抗药性标记选择,目 录,互补,pBR322,互补的检测,组氨酸缺陷 型大肠杆菌,无组氨酸 的培养基,酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,目 录,二、利用重组DNA技术可分离、克隆单个基
14、因,（一）候选基因有染色体DNA和cDNA两种来源 待克隆DNA的来源可以是染色体DNA，也可以是cDNA。这需根据实验目的进行选择。如果对蛋白质的氨基酸序列感兴趣则采用cDNA为来源的克隆策略。如果对基因的表达调控或编码区的间隔序列感兴趣，则选择基因组DNA克隆的策略。 可以通过构建基因组DNA文库(genomic DNA library)或 cDNA文库(cDNA library)来克隆目的基因。,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,* 从基因组DN
15、A文库获取目的基因,限制酶切位点,限制酶部分消化,外源DNA与载体DNA混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体 感染大肠杆菌,20 Kb DNA 片段,目 录,目 录,（三）利用分子探针筛选cDNA文库可分离特异编码序列,（二）利用核酸杂交从全基因组DNA文库中获取目的基因,与筛选基因组文库不同的是，只能用cDNA序列或基因组DNA编码序列做探针来筛选cDNA文库。如果已有分离、纯化的蛋白质，利用该抗原制备特异性抗体，也可作为分子探针用来筛选cDNA表达文库，获得已知蛋白质的cDNA克隆。,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,目 录,（四）某些转录因子的编码基因可通过特异杂交系统被克隆,酵母单杂交系统用于DNA结合蛋白的基因克隆 酵母双杂交系统用于特异性相互作用蛋白质的基因克隆,.,.,报告基因,报告基因,报告基因,A. 无转录因子：报告基因不表达,“诱饵”DNA序列,B. 有转录因子：报告基因表达,酵母单杂交系统,C. 有GAL4 AD/DNA结合蛋白-融合蛋白：报告基因表达,DNA结合蛋白,GAL4 AD,转录因子,.,报告基因,报告基因,酵母双杂交系统,B. 有相互作用的蛋白质，报告基因表达,启动子,A. 无相互作用的蛋白质，报告基因不表达,“诱饵”,“猎物”,AD,BD,上游激活序列,启动子,BD,“诱饵”,“猎物”,AD,上游激活序列,
