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1、色谱分析法 Chromatography,第一章 色谱法引论,一、概述 问题 问题1：什么是色谱法？ 问题2：为什么色谱法能将混合物分开？ 问题3：色谱法的分类？ 问题4：各种色谱法的应用范围？,1、什么是色谱法？,茨维特的实验 茨维特：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作，在1906 年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。,茨维特的实验,碳酸钙,石油醚,什么是色谱法？,Chromatography 色谱法是一种分离方法。 特点：有两相，一是固定相（stationary phase），一是流动相（mobile phase），两相作相向运动。 将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。 因此色谱分
2、析是一种分离、分析法。,2、色谱法分离原理,当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,3、色谱法的分类,按流动相状态的不同，可分为以下三类： 气相色谱法 (Gas Chromatography, GC) 液相色谱法 (Liquid Chromatography，LC) 超临界流体色谱 (Supercritical Fluid Chromatography，SFC),色谱分析仪器流程,流动相携带进
3、样装置引入的混合试样进入色谱柱 混合试样在色谱柱中进行分离 各组分依次进入检测器检测 检测响应信号导入计算机 得到色谱图,什么是气相色谱法？,以气体为流动相的色谱法 Gas Chromatogaphy，简称GC 按固定相状态的不同可分为： 气固色谱(GSC) 气液色谱(GLC),应用范围： 用于分离分析易汽化（在-190-500范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。,什么是液相色谱法？,以液体为流动相的色谱法 Liquid Chromatography，简称LC 应用范围： 用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。,其
4、他分类方式,按固定相使用的形式可分为 柱色谱（column chromatography） 将固定相装在色谱柱内 纸色谱（Paper Chromatography） 用滤纸做固定相或固定相载体的色谱 薄层色谱（Thin Lay Chromatography） 固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上,应用 TLC:,1 2 3 4 5 6 7 8 9,Bands Description 1 Pseudoginsenoside F11 2 American Ginseng 3 Ginsenoside Rg1 4 Ginsenoside Rf 5 Ginseng 6 Ginsenoside Rc 7 Gin
5、senoside Rb1 8 Notoginseng 9 Notoginsenoside R1,Identification of Ginseng, America ginseng and Notoginseng,二、色谱法基本理论,拟解决的问题 色谱相关术语 色谱法理论的概况 色谱中的动力学理论 色谱分离情况的评价方法 影响色谱分离的主要因素及条件选择（从理论的角度加以判断）,1、色谱相关术语,关于色谱峰 关于保留值 关于分配平衡,关于色谱峰的术语,峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,关于色谱峰的术语,峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为：W=4，Wh/2=2.354 拖尾峰 伸
6、舌峰 鬼峰、假峰 畸峰 峰底 基线漂移 基线噪声 谱带扩张,关于保留值的术语,死时间（t0，tM）：无保留组分出峰时间 保留时间（tR）： 调整保留时间（tR）：,关于保留值的术语,死体积（V0，VM）： 保留体积（VR）： 调整保留体积（V R）：,关于保留值的术语,相对保留值（ri,s）： 相对保留值又称为选择性因子（） 在气相色谱中，相对保留值的大小仅与固定相种类和柱温有关。,关于保留值的术语,保留指数（I）：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测
7、物的保留指数由下式计算：,关于分配平衡,分配系数K（distribution coefficient ）,关于分配平衡,分配比k：又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,关于分配平衡,相比： 色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。,2、色谱基本理论概述,研究理论的目的 解决色谱峰的分离问题 三个色谱基本理论问题 色谱热力学问题发展高选择性色谱柱 色谱动力学问题发展高效能色谱柱 分离条件的最优化问题分离条件优化,3、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影
8、响因素 塔板理论 速率理论,塔板理论,塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：,塔板理论,当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量W，是峰高定量的理论基础。 当n越大，柱效越大，Cmax/W越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。 Cmax反比于tR，tR小，Cmax大， 保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小， 保留时间大的组分峰低且宽。,柱效,由流出曲线方程导出： H=L/n,柱效,n是峰相对展宽的量度 n是柱效的量度 n是常数时，Y与tR 成正比 n越大，h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。,塔板
9、理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。 导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。 导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。 不能解释流速对理论塔板数的影响。 有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。,4. 色谱相关术语,关于色谱峰 关于保留值 关于分配平衡,关于色谱峰的术语,峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为： W=4，Wh/2=2.354 拖尾峰 伸舌峰 鬼峰、
10、假峰 畸峰 峰底 基线漂移 基线噪声 谱带扩张,关于保留值的术语,死时间(tM): 无保留组分出峰时间 保留时间(tR): 调整保留时间(tR): 死体积(VM): 保留体积(VR): 调整保留体积(VR):,相对保留值(ri,s): 保留指数(I)：又叫Kovats，它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指数由下式计算：,关于分配平衡,分配系数K (distribution coefficient ) 分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压
11、力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,相比 色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。,二、色谱分析法基本理论,研究理论的目的 解决色谱峰的分离问题 三个色谱基本理论问题 色谱热力学问题发展高选择性色谱柱 色谱动力学问题发展高效能色谱柱 分离条件的最优化问题分离条件优化,1、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素 塔板理论 速率理论,（1）塔板理论,推导 塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：,为标准偏差,当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量C0，是峰高定量的理论基础。
12、当n越大，柱效越大，Cmax/ C0越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。 Cmax反比于tR，tR小，Cmax大， 保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小， 保留时间大的组分峰低且宽。,对色谱流出曲线方程的讨论,柱效,由流出曲线方程导出： H=L/n n是峰相对展宽的量度 n是柱效的量度 n是常数时，Y与tR 成正比 n越大，h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。,塔板理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。 导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。 导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价
13、指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。 不能解释流速对理论塔板数的影响。 有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。,速率理论,速率理论是1956年荷兰学者Van Deemter等提出，因此又称作范第姆特方程 运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素,速率方程的导出,根据塔板计算公式： n=5.54(tR/Y1/2)2 速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是影响塔板高度H的因素。 H
14、=A+B/u+Cu,涡流扩散项,A=2dp,涡流扩散项,均匀性因子,粒径,涡流扩散项,涡流扩散项A：由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。,分子扩散项,B/u B=2Dg,弯曲因子,扩散系数,分子扩散项,分子扩散项：由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运
15、动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展,传质阻力项,气相传质阻力项,气相传质阻力项Cg：试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。,气相传质阻力项表达式,Cgu Cg =,容量因子,液相传质阻力项,液相传质阻力项CL：试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。,液相传质阻力相表达式,CL u CL =,液膜厚度,液相扩散系数,气
16、相色谱中的速率方程,速率方程给我们的什么启示,为柱型的研究和发展提供理论依据 为操作条件的选择提供理论指导 为色谱柱的填充提供理论指导,对柱型研究和发展的影响,A=0? Golay1957年提出毛细管柱的概念（opentube） 毛细管柱A=0，H=B/u+Cu H，N，分离能力大大提高,对柱型研究和发展的影响,B=0? 溶质在液体中的扩散系数DL10-5cm2/s 溶质在气体中的扩散系数Dg10-1cm2/s DL Dg 当采用液体作流动相时 B0 液体作流动相时可用更细的固定相，A HPLC柱效比GC要高23个数量级,操作条件对柱效的影响,载气线速度（流速）的影响,最佳流速：u=(B/C)1/2 实用最佳流速：比最佳流速更快 A与流速无关 B/u：当流速小时，对H的大小起主导作用 Cu：当流速大时，对H的大小起主导作用,容量因子k的影响,不同组分k不同，测出的柱效不同 在气相传质阻力相中，k ，C
