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1、色谱分析法 Chromatography,第一章 色谱法引论,一、概述 问题 问题1:什么是色谱法? 问题2:为什么色谱法能将混合物分开? 问题3:色谱法的分类? 问题4:各种色谱法的应用范围?,1、什么是色谱法?,茨维特的实验 茨维特:俄国植物学家,主要从事植物色素的研究工作,在1906 年发表的文章中,首次提出了色谱的概念。,茨维特的实验,碳酸钙,石油醚,什么是色谱法?,Chromatography 色谱法是一种分离方法。 特点:有两相,一是固定相(stationary phase),一是流动相(mobile phase),两相作相向运动。 将色谱法用于分析中,则称为色谱分析。 因此色谱分
2、析是一种分离、分析法。,2、色谱法分离原理,当流动相中所携带的混合物流过固定相时,就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异,与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下,不同组分在固定相中的滞留时间有长有短,从而按先后不同的次序从固定相中流出。,3、色谱法的分类,按流动相状态的不同,可分为以下三类: 气相色谱法 (Gas Chromatography, GC) 液相色谱法 (Liquid Chromatography,LC) 超临界流体色谱 (Supercritical Fluid Chromatography,SFC),色谱分析仪器流程,流动相携带进
3、样装置引入的混合试样进入色谱柱 混合试样在色谱柱中进行分离 各组分依次进入检测器检测 检测响应信号导入计算机 得到色谱图,什么是气相色谱法?,以气体为流动相的色谱法 Gas Chromatogaphy,简称GC 按固定相状态的不同可分为: 气固色谱(GSC) 气液色谱(GLC),应用范围: 用于分离分析易汽化(在-190-500范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的)稳定、不易分解、不易反应的样品,特别适合用于同系物、同分异构体的分离。,什么是液相色谱法?,以液体为流动相的色谱法 Liquid Chromatography,简称LC 应用范围: 用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。,其
4、他分类方式,按固定相使用的形式可分为 柱色谱(column chromatography) 将固定相装在色谱柱内 纸色谱(Paper Chromatography) 用滤纸做固定相或固定相载体的色谱 薄层色谱(Thin Lay Chromatography) 固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上,应用 TLC:,1 2 3 4 5 6 7 8 9,Bands Description 1 Pseudoginsenoside F11 2 American Ginseng 3 Ginsenoside Rg1 4 Ginsenoside Rf 5 Ginseng 6 Ginsenoside Rc 7 Gin
5、senoside Rb1 8 Notoginseng 9 Notoginsenoside R1,Identification of Ginseng, America ginseng and Notoginseng,二、色谱法基本理论,拟解决的问题 色谱相关术语 色谱法理论的概况 色谱中的动力学理论 色谱分离情况的评价方法 影响色谱分离的主要因素及条件选择(从理论的角度加以判断),1、色谱相关术语,关于色谱峰 关于保留值 关于分配平衡,关于色谱峰的术语,峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,关于色谱峰的术语,峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为:W=4,Wh/2=2.354 拖尾峰 伸
6、舌峰 鬼峰、假峰 畸峰 峰底 基线漂移 基线噪声 谱带扩张,关于保留值的术语,死时间(t0,tM):无保留组分出峰时间 保留时间(tR): 调整保留时间(tR):,关于保留值的术语,死体积(V0,VM): 保留体积(VR): 调整保留体积(V R):,关于保留值的术语,相对保留值(ri,s): 相对保留值又称为选择性因子() 在气相色谱中,相对保留值的大小仅与固定相种类和柱温有关。,关于保留值的术语,保留指数(I):又叫Kovats,它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍,其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系,其中一种碳数为Z,另一种为Z+1,被测
7、物的保留指数由下式计算:,关于分配平衡,分配系数K(distribution coefficient ),关于分配平衡,分配比k:又称为容量因子、容量比、分配容量,是指在一定温度和压力下,平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,关于分配平衡,相比: 色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。,2、色谱基本理论概述,研究理论的目的 解决色谱峰的分离问题 三个色谱基本理论问题 色谱热力学问题发展高选择性色谱柱 色谱动力学问题发展高效能色谱柱 分离条件的最优化问题分离条件优化,3、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影
8、响因素 塔板理论 速率理论,塔板理论,塔板理论将色谱柱比作精馏塔,通过概率理论得到流出曲线方程:,塔板理论,当t=tR时,C=Cmax,峰高正比于进样量W,是峰高定量的理论基础。 当n越大,柱效越大,Cmax/W越大。即保留时间一定时,塔板数越多,峰越高。 Cmax反比于tR,tR小,Cmax大, 保留时间小的组分峰高且窄。tR大,Cmax小, 保留时间大的组分峰低且宽。,柱效,由流出曲线方程导出: H=L/n,柱效,n是峰相对展宽的量度 n是柱效的量度 n是常数时,Y与tR 成正比 n越大,h越小,表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多,对分离越有利,但还不能预言各组分有被分离的可能性。,塔板
9、理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。 导出色谱流出曲线方程,它符合高斯分布,与实验现象相吻合。 导出理论塔板数的计算公式,作为柱效的评价指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量,它的色谱本质是什么?它与哪些参变量有关,又怎样影响峰的扩张?对实验的指导意义有限。 不能解释流速对理论塔板数的影响。 有些假设不合理,如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。,4. 色谱相关术语,关于色谱峰 关于保留值 关于分配平衡,关于色谱峰的术语,峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为: W=4,Wh/2=2.354 拖尾峰 伸舌峰 鬼峰、
10、假峰 畸峰 峰底 基线漂移 基线噪声 谱带扩张,关于保留值的术语,死时间(tM): 无保留组分出峰时间 保留时间(tR): 调整保留时间(tR): 死体积(VM): 保留体积(VR): 调整保留体积(VR):,相对保留值(ri,s): 保留指数(I):又叫Kovats,它规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍,其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系,其中一种碳数为Z,另一种为Z+1,被测物的保留指数由下式计算:,关于分配平衡,分配系数K (distribution coefficient ) 分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量,是指在一定温度和压
11、力下,平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,相比 色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。,二、色谱分析法基本理论,研究理论的目的 解决色谱峰的分离问题 三个色谱基本理论问题 色谱热力学问题发展高选择性色谱柱 色谱动力学问题发展高效能色谱柱 分离条件的最优化问题分离条件优化,1、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素 塔板理论 速率理论,(1)塔板理论,推导 塔板理论将色谱柱比作精馏塔,通过概率理论得到流出曲线方程:,为标准偏差,当t=tR时,C=Cmax,峰高正比于进样量C0,是峰高定量的理论基础。
12、当n越大,柱效越大,Cmax/ C0越大。即保留时间一定时,塔板数越多,峰越高。 Cmax反比于tR,tR小,Cmax大, 保留时间小的组分峰高且窄。tR大,Cmax小, 保留时间大的组分峰低且宽。,对色谱流出曲线方程的讨论,柱效,由流出曲线方程导出: H=L/n n是峰相对展宽的量度 n是柱效的量度 n是常数时,Y与tR 成正比 n越大,h越小,表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多,对分离越有利,但还不能预言各组分有被分离的可能性。,塔板理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。 导出色谱流出曲线方程,它符合高斯分布,与实验现象相吻合。 导出理论塔板数的计算公式,作为柱效的评价
13、指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量,它的色谱本质是什么?它与哪些参变量有关,又怎样影响峰的扩张?对实验的指导意义有限。 不能解释流速对理论塔板数的影响。 有些假设不合理,如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。,速率理论,速率理论是1956年荷兰学者Van Deemter等提出,因此又称作范第姆特方程 运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素,导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系,揭示了影响塔板高度的动力学因素,速率方程的导出,根据塔板计算公式: n=5.54(tR/Y1/2)2 速率理论讨论的是色谱峰展宽原因,即影响塔板数n的因素,也就是影响塔板高度H的因素。 H
14、=A+B/u+Cu,涡流扩散项,A=2dp,涡流扩散项,均匀性因子,粒径,涡流扩散项,涡流扩散项A:由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同,粒度分布范围不一致及填充的不均匀,形成宽窄、长短不同的路径,因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动,有些溶质分子沿较窄且直的路径运行,以较快的速度通过色谱柱,发生分子超前,反之,有些分子发生滞后,从而使色谱峰产生扩散。,分子扩散项,B/u B=2Dg,弯曲因子,扩散系数,分子扩散项,分子扩散项:由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后,是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中,由于在塞子前后存在浓度梯度,因此使运
15、动着的分子产生纵向扩散,引起色谱峰扩展,传质阻力项,气相传质阻力项,气相传质阻力项Cg:试样组分从气相移动到固定相表面的过程中,由于质量交换过程需要一定时间(即传质阻力)而使分子有滞留倾向。在此过程中,部分组分分子随流动相向前运动,发生分子超前,引起色谱峰扩展。,气相传质阻力项表达式,Cgu Cg =,容量因子,液相传质阻力项,液相传质阻力项CL:试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中,由于质量交换过程需要一定时间(即传质阻力)而使分子有滞留倾向。在此过程中,部分组分分子先离开固定相表面,发生分子超前,引起色谱峰扩展。,液相传质阻力相表达式,CL u CL =,液膜厚度,液相扩散系数,气
16、相色谱中的速率方程,速率方程给我们的什么启示,为柱型的研究和发展提供理论依据 为操作条件的选择提供理论指导 为色谱柱的填充提供理论指导,对柱型研究和发展的影响,A=0? Golay1957年提出毛细管柱的概念(opentube) 毛细管柱A=0,H=B/u+Cu H,N,分离能力大大提高,对柱型研究和发展的影响,B=0? 溶质在液体中的扩散系数DL10-5cm2/s 溶质在气体中的扩散系数Dg10-1cm2/s DL Dg 当采用液体作流动相时 B0 液体作流动相时可用更细的固定相,A HPLC柱效比GC要高23个数量级,操作条件对柱效的影响,载气线速度(流速)的影响,最佳流速:u=(B/C)1/2 实用最佳流速:比最佳流速更快 A与流速无关 B/u:当流速小时,对H的大小起主导作用 Cu:当流速大时,对H的大小起主导作用,容量因子k的影响,不同组分k不同,测出的柱效不同 在气相传质阻力相中,k ,C