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1、ICS65.020.20B 21DB32江苏省地方标准DB 32/T XXXXX2020玉米品种及纯度鉴定技术规程 SNP标记法Technical regulation for identification of maize varieties and purity SNP marker method2020 - XX - XX发布2020 - XX - XX实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T XXXXX2020前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：赵涵、张体付、吕远大、陈艳萍、林峰、
2、陆海燕、梁帅强。7玉米品种及纯度鉴定技术规程 SNP标记法1 范围本标准规定了利用SNP（single nucleotide polymorphism）标记进行玉米品种及纯度鉴定的原理、仪器设备及试剂、引物信息、操作步骤等要求。本标准适用于玉米自交系、单交种及纯度的鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1SN
3、P标记 single nucleotide polymorphism marker基于单核苷酸多态性的分子标记。3.2推荐引物 recommended primer 品种鉴定中优先选用的一套SNP引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。3.3竞争性等位基因特异性PCR（KASP, Kompetitive Allele Specific PCR）通过引物末端特异性碱基竞争性匹配DNA模板实现SNP基因分型的链式聚合酶反应。3.4品种纯度 varietal purity品种在DNA分子标记基因分型方面一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占供检样品种子总数的百分率表示。4 原理 玉米基因组中普
4、遍存在着单碱基的变异，不同品种同一SNP位点的基因型可利用适宜引物通过KASP检出，进而根据SNP位点基因型的差异鉴定品种及纯度。5 仪器设备及试剂 见附录A。6 引物信息见附录B。7 操作步骤 7.1 样品DNA提取7.1.1 样品准备试验样品种子的分样与保存，应符合GB/T 3543.2的规定。7.1.2 用于品种鉴定样品DNA提取从送检样品中随机抽取10粒种子发苗。分单株剪取100mg幼苗用液氮研磨，将研磨粉末转入2mL离心管，加入0.5mL2CTAB提取缓冲液充分混匀。在5565恒浴30min。加入1mL氯仿:异戊醇（24：1），充分摇动5min，8000g，室温下离心5min。取上清
5、液加入0.6体积异丙醇，室温下静置30min，5000g，4离心5min。沉淀用0.8mL高盐缓冲液充分溶解，15000g离心2 min。上清加入0.6体积异丙醇，室温下静置30min，5000g，4离心5min。沉淀用400 L双蒸水溶解，加入2.5体积95%的预冷乙醇，20冰箱放置2 h以上，15000 g 离心20 min。用70%的预冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200L0.1TE缓冲液溶解，置4保存。注： 以上为推荐用于品种鉴定的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于本标准。7.1.3 用于纯度鉴定样品DNA提取按GB/T 3543.4规定的方法，从送检
6、样品中抽取不少于100粒种子发苗。分单株剪取0.5 cm1 cm长的幼苗，放入96孔PCR板的孔中，每孔1株幼苗样品。每孔加入40 LDNA提取试剂盒缓冲液，在沸水中煮沸30s，然后加入60L DNA提取试剂盒缓冲液，在沸水中煮沸2min，置4保存，保存不超过7d。注： 以上为推荐用于纯度鉴定的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于本标准。7.2 PCR扩增7.2.1 引物筛选 用于品种及纯度鉴定的40组推荐引物及其序列参见附录B。自行筛选引物时，取送检杂交种及父、母本种子各5粒，通过KASP对一系列SNP分子标记引物进行筛选，确定适宜的引物。适宜引物应为能够清
7、晰区分杂交种及其父、母本的共显性引物。7.2.2 PCR反应体系 在5L的反应体系中进行扩增。反应体系包含0.07 L引物KASPAssay mix，2.5L 2KASP Master mix，50ng模板DNA。扩增反应条件为：PCR程序为94预变性15min；94变性20s，61退火和延伸60s，10个循环, 每个循环降低0.6； 94变性20s， 55退火和延伸60s，26个循环。反应利用96孔PCR板在PCR扩增仪上进行。7.3 基因分型检测在微孔板荧光分析仪上读取荧光信号, 使用荧光结果处理软件按照分型明确、NTC (无样品阴性对照)无特异性扩增的原则进行样品SNP分型。7.4 数据
8、采集与判定7.4.1 数据记录纯合位点的基因型数据记录为X/X和Y/Y，其中X、Y为同一位点上两个不同的等位变异；杂合位点的基因型数据记录为X/Y；缺失位点等位变异数据记录为-/-。7.4.2 品种鉴定的判定根据送检样品在40个SNP位点基因型的差异进行品种鉴定，具体判定标准如下： 差异位点数4，判定为不同品种； 差异位点数1且3，判定为近似品种； 差异位点数=0，判定为极近似或相同品种。对利用附录B中40组引物仍未检测到4个差异位点数的样品，必要时可增加自行筛选引物进行检测。 7.4.3 纯度鉴定的判定品种纯度按照下列公式计算：品种纯度%（自交系）=（供检种子粒数-非本品种种子粒数）/供检种
9、子粒数100%品种纯度%（单交种）=（供检种子粒数-母本种子粒数-其他类型种子粒数）/供检种子粒数100%AA附录A （规范性附录）仪器设备及试剂配制A.1 仪器设备仪器设备包括： 微孔板荧光分析仪； PCR扩增仪； 电子天平（感量 0.01g，0.001g）； 冰箱； 微量加样器（0.1L2.5L, 0.5L10L, 20L200L, 100L1000L）； 磁力搅拌器； 高压灭菌锅； 酸度计等； 离心管（0.5mL，1.5mL）； 吸头(10L，200L，1000L)； 96孔PCR板；封板膜； 一次性手套； 离心管架； 水平仪。 A.2 试剂配制A.2.1 DNA提取试剂 称取1g氢氧化
10、钠溶于99mL水中。 A.2.2 DNA提取试剂 取10mL12mol/L的盐酸溶于470mL水中即成0.25mol/L盐酸。将0.25mol/L盐酸与0.5mol/LTris (PH8.0)按2：1稀释。 A.2.3 1mol/LTris溶液(PH8.0) 称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加入800mL双蒸水中溶解，加入浓盐酸58.4mL，加水定容至1000mL。 A.2.4 0.5mol/LEDTA溶液（PH8.0） 称取186.6g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O），加入700mL双蒸水中溶解，加入20g氢氧化钠，加水定容至1000mL。 A.2.5 2CTAB提取
11、缓冲液 2% CTAB（w/v），100mmol/LTris(pH8.0)，20mmol/LEDTA(pH8.0)，1.4mol/L氯化钠，1%PVP Mr40 000。称取20g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，81.9g氯化钠，10g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），加入100mL1mol/LTris溶液 (PH8.0)和40mL0.5mol/LEDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000mL。A.2.6 高盐缓冲液 10mmol/LTris(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，1 mol/L氯化钠。称取58.5 g氯化钠,加入10 mL 1mol/LTris溶液(PH8.0
12、)和2mL0.5mol/LEDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000mL。 A.2.7 0.1xTE缓冲液 1mmol/LTris(pH8.0)，0.1mmol/LEDTA(pH8.0)，1mL1 mol/LTris溶液(PH8.0)和0.2mL0.5 mol/LEDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000mL。 A.2.8 2KASP Master mix试剂包含TaqDNA聚合酶、带有荧光的接头序列、镁离子、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP），ROX内参荧光染料。A.2.9 KASP Assay mix包含46LddH2O、12L100mol/L特异性引物F1、12L100mol/L特异
13、性引物F2、30L100mol/L通用引物。BB附录B （规范性附录）推荐使用的40组SNP引物序列及其玉米基因组分布推荐使用的40组SNP引物序列及其玉米基因组分布见表B.1。表B.1 40组SNP引物序列及其玉米基因组分布引物名称染色体引物序列（5-3）PCR扩增序列（bp）b正向a反向（通用）起始位置终止位置扩增长度JAASKASP11catgtaaataggaaccttgttctcgtAatgtaaataggaaccttgttctcgtCagtcactcaaacatgttcgttgtccaaa443781524437820756JAASKASP21tgcattggctgacatggtaCtgcattggctgacatggtaGacttgcagaagctccagagt11233739311233747280JAASKASP31agcataactaggacaaccattgaTagcataactaggacaaccattgaGggaactaatggcacggttcc15820113315820118755JAASKASP41aacatgtgatggtttgggtatgGaacatgtgatggtttgggtatgCcattcgtcaatgatgt
