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1、第四章细胞规模化培养技术,细胞工程电子课件,华中农业大学生命科学技术学院,概述,生物反应器的类型与特点,细胞规模化培养的主要技术环节,规模化培养中常见的问题与解决途径,主要内容,4.1 概述,细胞规模化培养在现代工业中的潜力 高等生物细胞规模化培养现状,植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。 李时珍（1593）在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。 许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。,Pro
2、ducts Synthesized Using Cell Culture,（引自Ramawat和Merillon，1999 ）,Products Synthesized Using Cell Culture,（引自Ramawat和Merillon，1999 ）,规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径。 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业,来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较,（引自熊宗贵，1999）,Examples of enhancement in natural product yield in selected cell lines compare with par
3、ent plant material. (After Fowler, 1983),70年代后期，基因工程使得外源基因成功地在微生物中得以表达，由于其简单快速、生产效率高，逐渐形成了以原核细胞为培养对象的基因工程技术和大规模微生物培养技术，一度大有取代动物细胞培养这势。 但许多生物活性蛋白不能在微生物工程菌细胞中表达，而只能在动物细胞中产生。也不能将蛋白质产物自动分泌到细胞外，给产物分离带来麻烦。,80年代后，随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展，已经能够把特定的外源基因通过PCR技术扩增几千倍，并可转染到动物细胞内，使其高效表达。 动物细胞培养生产的各种产品是其他植物、微生物细胞培养所无法
4、比拟的，在人类生活特别是医学中发挥越来越大的作用。,4.1.2 高等生物细胞规模化培养现状,1956年，Nichell和 Routin提出了植物细胞培养生产化合物的第一个专利申请。 20世纪60年代以来，组织培养的迅速发展为细胞培养奠定了技术基础。各种细胞培养基的设计、植物细胞生物反应器的研制、植物细胞培养动力学研究、植物细胞培养生产次级代谢物的调节控制理论与应用等方面的研究都取得了显著进展。,1979年，国际组织培养协会专业术语委员会建议将组织培养和细胞培养的概念加以区分。以此为契机，20世纪80年代以来植物细胞培养进入了高速发展阶段。 愈伤组织培养既属于组织培养又属于细胞培养。,1983年
5、，日本三井石油化学工业公司再世界上首次成功的采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。 此后，人参细胞培养生产人参皂苷，黄连细胞培养生产小檗碱，长春花细胞培养生产长春花碱，红豆杉细胞培养生产紫杉醇等相继取得成功，迄今为止，已经从400多种植物中分理出细胞，并通过细胞培养，获得600多种化合物。,植物细胞大规模培养的技术要求： 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统； 从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物；细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物；代谢产物要在细胞中积累
6、而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。,表动物细胞培养的产物,一、植物细胞规模化培养过程的特点及对反应器 的要求,与微生物细胞的差别 抗剪切能力弱 有聚集成团的趋势 好气性 操作周期较长,4.2 生物反应器的类型与特点,总体上讲，适合植物细胞培养的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力，根据不同植物细胞生长和代谢产物积累特点。,二、植物细胞反应器的类型与特点,植物细胞培养生物反应器*,* 引自黄艳等，2001。,（一）机械搅拌式反应器,图4-1 标准搅拌式生物反应器结构示意图,图4-2 搅拌桨的类型,（1）搅拌桨型式的改进： 一般认为，涡轮状叶轮优于平叶轮，而平叶轮又优于螺
7、旋状叶轮。因此采用适宜的搅拌桨类型和结构可使植物细胞的生长不受损害，最常用的是标准Rushton涡轮机。 在高粘度培养基中，需要使用其他类型直径较大的叶轮，如大的搅拌桨及螺旋式叶轮。 法国Inceltech公司成功地研制了带有倾斜刀片的涡轮，该结构提供了混合的轴向流和辐射流。,Kaman等设计了带有一个双螺旋带状叶轮和三个表面挡板的搅拌罐，实验证明其适合于剪切力敏感的细胞高密度培养。 钟建江等通过培养紫苏细胞进行比较，发现带以微孔金属丝网作为空气分布器的三叶螺旋桨反应器 (MRP) 能提供较小的剪切力和良好的供氧及混合状态，优于六平叶涡轮桨反应器，并认为在高浓度细胞培养时，MRP型反应器将显示
8、更大的优越性。,（2）搅拌方式也会对剪切剪切作用产生影响,HvoslefEide等利用螺旋形搅拌式生物反应器对挪威云杉( Picea abies) 和桦树( Betula pendula) 的体胚进行大量繁殖，发现在较低的搅拌速度下变换搅拌的方向可以降低剪切力，搅拌器的搅拌方向每10s变换1次时，30rpm的搅拌速度就可以有较好的混合性能。,（二）非机械搅拌式反应器,图4-3鼓泡式反应器结构示意图,、鼓泡式与气升式反应器,鼓泡式反应器通过反应器底部的喷嘴及多孔板实现气体分散，促进液体流动。这种方式所提供的搅拌力要比搅拌式生物反应器柔和得多，于是混合可以在很低的剪切力条件下实现。但鼓泡式反应器对
9、氧的利用率较低。,2、气升式反应器,气升式反应器通过在鼓泡式反应器内部增加一个通气管而提高混合效率。气体在通气管轴部喷射，依靠这种方式传递动量和能量，通过上升液体和下降液体的静压差实现气流循环，以保证良好的传热和传质,并且不出现死角,流动形式比鼓泡式更均一。,图4-4气升式反应器结构示意图,3、转鼓式反应器,转鼓式生物反应器是一种新型的反应器, 它是利用转子的转动促进液体中溶氧与营养物的混合。通过应用不同反应器对烟草细胞悬浮培养的研究发现，相同条件下转鼓式反应器中细胞生长速率高，其氧的传递及细胞所受剪切损伤均优于气升式反应器。,图4-5 转鼓式反应器结构示意图,可以较容易地控制培养系统的理化环
10、境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节； 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成； 由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用； 正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。,(三） 固定化反应器,细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类： a、包埋式固定化培养系统：支持物多采用
11、琼脂、琼脂糖、藻酸盐聚丙烯酰胺等； b、附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。,图4-6 固定化系统示意图 a：固定床反应器；b:流化床c：膜反应器,图4-8不同膜反应器的结构示意图 a：单膜式平板膜反应器；b：双膜式平板膜反应器； c：多膜式平板膜反应器；d：管式膜反应器,三、植物细胞反应器系统的设计与控制,氧气的运输速率（OTR）由以下方程式给出： 式中， 液相运输系数（ ）； a总界面面积（ ）； 溶解氧的理论饱和浓度（ ）； 任何情况下液相中实际测量的溶解氧浓度（ ）。,（一）氧气供应,图4-9 氧气的运输过程及反应器中运输的界限,（二）光照系统的增设,考
12、虑：光源的安装、光的传递、反应器供气混合的影响等。 小规模实验：可采用外部光照的方法 大规模生产：着手研究内部光源反应器。,（三）培养控制,四、动物细胞规模化培养生物反应器,（一）经典的动物细胞培养反应器,、搅拌式生物反应器(Stirred tank bioreactor),2、气升式反应器 (Air-lift bioreactor),4、填充床反应器(Packed bed bioreactor),3、流化床反应器（Fluidized bed reactor）,、中空纤维反应器(Hollow fiber bioreactor),供氧方式的改进,、搅拌式生物反应器(Stirred tank bi
13、oreactor),图4-10Spier设计的笼式通气装置,图4-11CelliGen笼式通气搅拌器,图4-12 CelliGen细胞培养罐,图4-13 CellCul-50细胞培养反应器,搅拌桨的改进 反应器中的搅拌桨主要有两种类型：一种是放射向流叶轮，一种是轴向流叶轮。 在动物细胞培养中宜采用轴向流搅拌桨，使流体流动的方向平行于轴向。,图4-12两种搅拌桨的形状,图4-15 两种搅拌桨产生的流动情形,1979年，Katinger等人首次应用气生式生物反应器进行动物细胞悬浮培养。 英国Celltech公司是应用气升式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例。 1985年应用100L规模的气
14、升式生物反应器大规模培养杂交瘤细胞; 目前已开发出10000L规模的气升式生物反应器用于各类单抗的大量生产。,2、气升式反应器 (Air-lift bioreactor),图4-16 气升式反应器类型 (a)内循环式； (b)外循环式,3、流化床反应器（Fluidized bed reactor）,图4-17 流化床结构示意图,4、填充床反应器(Packed bed bioreactor),图4-18 CelliGen Plus填充床反应器,、中空纤维反应器( hollow fiber bioreactor),图4-19 中空纤维管扫描图片及其反应器示意图,实验室规模反应器,工业规模反应器,1
15、00 L 500,000 L,Process control and monitoring,Process parameters to be monitors,Sugar consumption,pH,Temperature,Fermentation time (h),Agitation,Cell Dry Weight,Product,Computer softwares have been developed to monitor and change the process on line,（二）新型动物细胞培养反应器,图4-20 CellCube贴壁细胞培养系统,CellCube细胞方块
16、,图4-21摇袋式细胞培养生物反应器工作示意图,旋转式细胞培养系统(the rotary cell culture syetem，RCCS),摇袋式细胞培养生物反应器(Wave Bioreactor),(三)反应器培养中的关键问题及解决途径,搅拌桨设计 加设导流筒 减小气泡尺寸 供氧方式的改变,4.3 细胞规模化培养的主要技术环节,种子细胞的繁殖与培养系统的建立,细胞规模化培养与调控,目的产物的分离与纯化,4.3.1 种子细胞的繁殖与培养系统的建立,种子细胞选择,外植体选择,高产细胞选择,植物类型：植物细胞的遗传基础是天然产物生产的基本影响因素，不同植物产生的天然产物种类之所以不同，从根本上来说是因为它们具有不同的遗传基础。在确定生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及其品种或单株。,组织器官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物次生代谢产物的积累具有组织器官特异性，因此，在起始细胞培养时应尽量选择自然状态下产生天然产物的器官、组织为外植体。,部分代表性植物
